基于网络药理学与分子对接探讨二至丸“异病同治”治疗围绝经期综合征及异常子宫出血的作用机制

伍娟娟 韦美秀 刘锐

二至丸原名“女贞丸”,由等份女贞子、墨旱莲组成,首载于《扶寿精方》,明代王三才在《医便》中将其更名为二至丸。女贞子甘、苦、凉,功能滋补肝肾,凉血止血;墨旱莲甘、酸、寒,有补益肝肾、明目乌发之效。两药同归肝、肾经,均为临床常用补阴药,两药组方可加强补益肝肾,滋水涵木之功。《医方集解》言其能“补腰膝,壮筋骨,强阴肾,乌髭发”,是补肝益肾,滋阴止血的经典方剂。

围绝经期综合征(menopausal syndrome,MPS)是指妇女绝经前后卵巢功能衰退,雌激素分泌减少或水平波动而导致的一系列自主神经功能紊乱或伴有神经心理症状的临床综合征[1-2],临床常见围绕月经紊乱或出现烘热汗出、烦躁易怒、心悸失眠、精神倦怠、腰酸背痛等与绝经相关的不适症候[3],研究表明约80 %的女性会出现不同程度的更年期症状[4]。现代医学性激素替代疗法通过调整体内雌激素水平能有效改善患者不适症状,但长期使用会增加乳腺癌、静脉血栓、子宫内膜癌等风险[5]。异常子宫出血(abnormal uterine bleeding,AUB)是妇科常见病,临床上常表现为非行经时阴道不规则出血,量或多或少,可引起不同程度的贫血、盆腔炎性疾病、影响女性生育等多种并发症,对女性的生活质量及身心健康造成严重影响。该病多发于围绝经期,与下丘脑—垂体—卵巢轴功能障碍导致无排卵密切相关[6]。围绝经期女性卵巢功能衰退,卵巢内剩余卵泡对垂体促性腺激素反应性降低,雌激素分泌减少,无排卵前黄体生成素(luteinizing hormone,LH)峰的形成,引起无排卵,此时子宫内膜受到单一雌激素的影响而无孕激素对抗常导致异常子宫出血的发生[7]。

MPS属中医“绝经前后诸证”范畴,中医认为肾为先天之本,妇女绝经前后肾气渐衰,天癸近竭,肾精亏虚、阴阳失调、冲任气血不足为本病基本病机[8],临床上使用二至丸加味治疗肝肾亏虚型MPS能有效改善患者潮热汗出、失眠等临床症状,降低卵泡雌激素(follicle-stimulating hormone,FSH)水平,同时与现代医学雌激素补充治疗相比无增加患者子宫内膜癌等风险的优势[9-10]。AUB相当于中医所言“崩漏”,崩漏为经乱之甚,中医认为冲任二脉损伤不能制约经血为其基本病机,究其原因,或肾气不固,不能调经摄血;或热扰冲任,迫血妄行;或肝肾功能失调,血海蓄溢失常等。现代医学在治疗上常以口服性激素药物或诊断性刮宫为主,性激素治疗因胃肠道反应及肝功能损害等不良反应一般不宜长期使用[11],且停药易复发,而手术方法患者接受度不高,使其治疗存在一定局限性。临床上将二至丸联合西药治疗肝肾亏虚型AUB疗效率高,且在月经周期的恢复上有显著优势[12]。

“异病同治”是指具有相同病机的不同疾病能采用同一方法治疗的法则,“证同则治同,证异则治异”,中医治病不拘泥于病的异同,而着眼于病机的异同[13]。MPS和AUB虽属于不同疾病,但其发病均与卵巢功能衰退、内分泌失调密切相关,从中医辨证论治角度分析,肝肾亏虚为其二者共有病机,二至丸在治疗MPS和AUB方面发挥了独特优势,符合中医“异病同治”的理念。网络药理学利用生物信息网络,系统反应药物对疾病的干预机制,从整体探索中药和机体的作用关系,切合中医整体论的思想[14]。本研究旨在运用网络药理学方法,从“异病同治”角度探讨二至丸治疗MPS和AUB的作用机制,为临床研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 二至丸药物活性成分及潜在作用靶点的获取

以“女贞子”“墨旱莲”为关键词在TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php/)中进行检索,以口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%,类药性(drug-likeness,DL)≥0.18作为筛选条件,初步筛选出二至丸药物活性成分。进一步检索获取药物活性成分潜在作用靶点,利用Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)将靶点名称转化为标准基因名。

1.2 MPS及AUB疾病靶点的获取

分别以“perimenopausal syndrome、climacteric syndrome、Menopausal syndrome、Menopausal symptoms”及“metrorrhagia 、AUB”为关键词,通过GeneCards(https://www,genecards.org/)数据库进行检索,获得MPS及AUB的相关疾病靶点,分别将获取疾病靶点整合去重后筛选,利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html/)对疾病靶点取交集,得到MPS及AUB的共有靶点。

1.3 药物—活性成分—靶点网络的构建

利用Venny 2.1.0对二至丸潜在作用靶点与MPS及AUB的共有靶点取交集,并绘制韦恩图,得到二至丸异病同治治疗MPS及AUB的潜在作用靶点,根据潜在作用靶点筛选出对应的二至丸药物活性成分,将药物、活性成分及作用靶点等信息导入Cytoscape 3.9.0软件,构建二至丸异病同治治疗MPS及AUB的药物-活性成分-靶点网络图。

1.4 蛋白相互作用网络(protein-protein interaction,PPI)的构建及核心靶点的筛选

将二至丸异病同治治疗MPS及AUB的潜在作用靶点导入STRING(https://string-db.org/)在线平台,物种选择“Homo sapiens”(人类),“medium confidence”(中等置信度)为0.4作为筛选条件,其余参数保持默认值,构建蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI),将结果以TSV文件格式导入Cytoscape 3.9.0平台进行拓扑分析,根据度值(Degree)筛选核心靶点。

1.5 GO和KEGG富集分析

采用Metascape平台(https://metascape.org/)对二至丸异病同治治疗MPS及AUB的潜在作用靶点进行GO和KEGG富集分析,将结果导入Excel表格,数据按Pvalue值以升序进行排序,以P<0.05为筛选标准,利用微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)对分别对GO富集的前10个及KEGG富集的前20个条目进行可视化处理。

1.6 分子对接

从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载核心靶点的3D结构,从TCMSP下载药物活性成分的mol2格式,Pymol软件去水、加氢、去配体残基,使用Autodock 4.2.6进行对接,获取靶点与活性成分的最低结合能,并使用 Pymol 2.5.0进行可视化处理。

2 结果

2.1 二至丸药物活性成分及潜在作用靶点的获取

通过TCMSP共检索到二至丸共有23种药物活性成分,其中女贞子活性成分13个、墨旱莲活性成分10个,删除无对应靶点活性成分后得到女贞子、墨旱莲有效活性成分各8个,其中共有活性成分2个,见表1。进一步利用 TCMSP对药物活性成分进行靶标预测,分别获得女贞子、墨旱莲对应活性成分靶点321及264个,合并后删除重复靶点得到195个。

表1 二至丸药物活性成分

2.2 MPS及AUB疾病靶点的获取

通过GeneCards数据库分别获得MPS及AUB相关靶点3490、485个,以相关性分数(Relevance score)大于等于中位数为条件进行筛选,最终选取得到MPS及AUB相关靶点1745及182个,利用Venny 2.1.0对疾病靶点取交集,并进行可视化,得到疾病共有靶点110个,见图1。

图1 MPS及AUB疾病靶点交集韦恩图

2.3 药物—活性成分—靶点网络构建

将二至丸潜在作用靶点与MPS及AUB共有靶点取交集,得到28个交集靶点,即为二至丸异病同治治疗MPS及AUB的潜在作用靶点,见图2。根据潜在作用靶点反向筛选出对应的二至丸药物活性成分,其中女贞子9个、墨旱莲6个,其中共有活性成分2个。利用Cytoscape 3.9.0构建药物—活性成分—靶点网络图,见图3。该网络由40个节点、72条边构成,其中包含28个交集靶点、2个药物及10个药物活性成分。利用Network Analyzer插件进行网络拓扑分析,将药物活性成分按照Degree值进行排序,前5位的活性成分分别为槲皮素(quercetin,degree=27)、木犀草素(luteolin,degree=12)、山奈酚(kaempferol,degree=9)、金合欢素(acacetin,degree=5)及β-谷甾醇(beta-sitosterol,degree=4),以上活性成分可能为二至丸治疗MPS及AUB的关键活性成分。

图2 疾病共有靶点与二至丸靶点交集韦恩图

注绿色箭头及圆形分别代表女贞子及其活性成分,蓝色箭头及圆形分别代表墨旱莲及其活性成分,红色圆形为药物共有成分,粉色菱形为药物与疾病交集靶点。图3 二至丸异病同治治疗MPS及AUB的药物-活性成分-靶点网络

2.4 PPI的构建及核心靶点的筛选

将28个药物与疾病的交集靶点导入STRING数据库构建PPI网络,该网络包括28个节点、193条边,其中孤立节点1个,以medium confidence>0.4为筛选标准,将筛选结果以TSV文件格式导入Cytoscape 3.9.0软件,利用Network Analyzer 插件进行拓扑分析,计算出该网络平均 Degree 值为3.6,平均接近中心性为0.431511,平均介数中心性为0.036032。根据结果进行可视化,网络中点的大小及颜色深浅与度值的大小呈正相关,度值越大颜色越深、节点越大(见图4)。根据Degree值大小筛选出排名前10的靶点作为二至丸异病同治治疗MPS及AUB的核心靶点,包括EGFR、TP53、ESR1、VEGFA、MMP9、IL-1β、HIF-1α等,见表2。

图4 二至丸异病同治治疗MPS及AUB潜在作用靶点PPI网络

表2 二至丸异病同治治疗MPS及AUB潜在作用靶点PPI网络前10位靶点拓扑分析

2.5 GO和KEGG富集分析

对28个交集靶点进行GO富集分析,共得到651条GO富集条目(P<0.05),其中生物过程(biological processes,BP)575条,主要涉及生殖结构发育、生殖系统发育、细胞迁移的上调、细胞对脂质的反应、腺体发育、细胞对有机环状化合物的应答等生物过程;细胞组分(cell components,CC)18条,主要包括转录调控复合物、细胞外基质、囊泡腔、转录抑制因子复合物等;分子功能(molecular function,MF)60条,涉及转录调控剂结合、转录共激活剂结合、转录因子结合、核受体活性等,分别对BP、CC及MF前10个条目进行可视化,见图5。KEGG富集分析得到96条相关通路(P<0.05),对前20条通路进行可视化展示,见图6,可见主要涉及AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等。

图5 二至丸异病同治治疗MPS及AUB潜在作用靶点GO富集分析

图6 二至丸异病同治治疗MPS及AUB潜在作用靶点KEGG富集分析

2.6 分子对接

选取关键活性成分槲皮素、木犀草素及山奈酚为对接配体,根据文献从核心靶点中筛选出EGFR、ESR1、HIF-1α、IL-1β、VEGFA为对接受体,进行对接并获取最低结合能,一般认为配体与受体结合能越低,其对接能力越强,通常以结合能<-5.0 KJ/mol(约为-1.2 Kcal/mol)作为结合性良好的筛选标准[15]。结果显示,二至丸关键活性成分与EGFR、ESR1、HIF-1α、IL-1β、VEGFA的对接结合能均小于-5.0 KJ/mol,其中槲皮素与HIF-1α(PDB ID:4h6j)、木犀草素与ESR1(PDB ID:1 err)、山奈酚与VEGFA(PDB ID:1 mjv)亲和力最高,其结合能分别为-4.1 Kcal/mol、-4.87 Kcal/mol、-4.47 Kcal/mol,见表3。分别选取各靶点与其对接结合能最低的活性成分绘制对接模式图,见图7。

注A:木犀草素-EGFR;B:木犀草素-ESR1;C:槲皮素- HIF-1α;D:山奈酚- IL-1β;E:木犀草素- VEGFA。图7 药物有效成分—靶点分子对接模式图

表3 二至丸关键活性成分与关键靶点分子对接结合能(Kcal/mol)

3 讨论

MPS及AUB为两种不同的疾病,但其发病均与卵巢功能衰退,雌激素分泌减少密切相关,中医病机以肝肾亏虚为多见。二至丸具有养阴清热止血,补益肝肾之功,临床运用该方治疗肝肾亏虚型MPS及AUB疗效确切[16-18]。现代研究表明,二至丸具有抗骨质疏松、抗衰老、调节免疫、护肝、雌激素样作用等多种作用药理学作用[19]。目前临床上常用于MPS、AUB等妇科病,同时也应用于肾病、皮肤病及内分泌疾病等多个领域,具有“一方多用、异病同治”的特点。本研究基于“异病同治”理论,运用网络药理学及分子对接方法,探讨二至丸异病同治治疗MPS及AUB的可能作用机制。

本研究对二至丸有效成分及作用靶点进行挖掘筛选,得到二至丸潜在活性成分14个,潜在作用靶点195个,与MPS及AUB的共有靶点为28个。药物—活性成分—靶点网络显示,槲皮素、木犀草素、山奈酚等为二至丸异病同治治疗MPS及AUB的关键活性成分。研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎及抗细胞凋亡等作用[20-21]。Jiao W等[22]人研究显示,槲皮素可通过上调绝经期大鼠卵巢及颗粒细胞中过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase,GSS)等氧化应激相关基因及蛋白的表达水平,以增加卵巢抗氧化能力。还可通过减弱脂质过氧化水平,保护颗粒细胞免受镉诱导的氧化应激损伤[23]。颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的重要原因,槲皮素通过抑制PERK/CHOP信号通路减轻内质网应激导致的颗粒细胞凋亡[24],发挥治疗作用。相关研究发现,IL-6等促炎因子在生殖年龄较大的小鼠卵巢中表达水平升高[25],这些因子可能促进卵巢慢性炎症及组织纤维化,破坏卵巢功能[26],提示炎症在卵巢衰老过程中发挥重要作用,槲皮素通过抑制NF-κB炎症信号级联反应,降低炎症因子水平,发挥抗炎效果[27]。槲皮素、木犀草素、山柰酚均属天然类黄酮化合物,类黄酮化合物其结构与雌激素具有极高的相似性[28],因此具有一定的雌激素样作用,补充槲皮素能改善卵母细胞质量及卵泡发育[29],低浓度的槲皮素能增加雌二醇的生物合成[30],另外木樨草素能促进卵巢颗粒细胞雌二醇的分泌[31],山奈酚可通过PI3K/Akt信号通路促进始基卵泡的活化及细胞增值[32]。同时山萘酚作为抗氧化剂,通过增加超氧化物歧化物(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽还原酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性促进体外培养的次级卵母细胞发育[33]。

对二至丸异病同治治疗MPS及AUB的共有靶点PPI网络进行筛选,得到EGFR、TP53、ESR1、VEGFA、MMP9、IL-1β、HIF-1α、MMP2、CCND1、MYC共10个核心靶点。其中ESR1是雌激素受体ERα亚型的编码基因,ERα主要表达于卵泡膜细胞上,调节雌激素的促增生作用,ESR1水平上调可影响其编码蛋白ERα的表达,进而影响血清雌二醇的水平的变化,从而对卵泡的发育、成熟及排出产生影响。VEGFA是血管内皮生长因子家族的一员,其血管形成及血管重塑作用能为卵泡的发育提供充足营养及氧气支持,并促进类固醇激素的释放。实验研究发现卵巢注射VEGF能促进卵巢卵泡发育,使排卵前卵泡数量增加[34],并且具有抑制卵巢颗粒细胞凋亡的作用[35]。研究认为生理情况下,IL-1β在FSH及LH的介导下通过诱导卵泡成熟、调节卵巢类固醇生成等方面,参与卵泡生长发育过程,IL-1β具有较强的抗促性腺激素作用,可通过抑制颗粒细胞孕酮分泌及雌激素、雄激素、LH受体的形成发挥阻止卵泡闭锁的作用[36]。马小红等[37]研究报道,卵巢早衰患者血清IL-1β水平低于正常妇女,IL-1β可能是引起自身免疫性卵巢早衰的重要因素。HIF-1α是细胞在缺氧环境中产生的调节因子,在卵巢内,HIF-1α可通过诱导颗粒细胞自噬、凋亡等细胞死亡途径,导致卵泡闭锁,引发POI[38],通过调节HIF-1α功能,阻断或减少其促凋亡及自噬作用可发挥卵巢保护功能。VEGF为HIF-1α下游靶基因,研究证实[39],在缺氧条件下HIF-1α调节VEGF基因的转录激活,促进血管生成。由此推断二至丸主要通过调节雌激素水平、促进卵泡发育、抑制颗粒细胞凋亡、阻止卵泡闭锁等途径改善卵巢功能,从而对围绝经期综合征及异常子宫出血发挥治疗作用。

GO功能显示,二至丸异病同治治疗MPS及AUB主要涉及生殖结构发育、生殖系统发育、细胞迁移的上调、细胞对脂质的反应、腺体发育等生物过程。KEGG富集分析结果提示,AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等是二至丸治疗治疗MPS及AUB的重要通路。AGEs 是非酶糖基化反应的终末产物,其在卵巢中积累可通过促蛋白损伤、氧化应激及炎症导致卵母细胞损伤[40]。AGEs与RAGE形成结合AGE-RAGE 信号通路,介导NADPH氧化酶(oxidase,Nox)和NF-κB激活,促进细胞中OS和炎症的恶性循环,导致卵巢衰老[41]。PI3K/Akt信号通路在调控卵巢颗粒细胞的增殖与凋亡中起重要作用,实验研究显示补肾活血中药可上调大鼠卵巢颗粒细胞中PI3K/Akt信号通路相关分子PI3K、p-Akt及上游细胞因子IGF-1、IRS-1的表达,加快颗粒细胞有丝分裂信号传递,促进颗粒细胞增值,从而促进卵泡生长,改善卵巢功能[42]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是PI3K/Akt信号通路下游重要蛋白,mTOR参与卵母细胞减数分裂成熟、卵巢颗粒细胞增殖、子宫内膜基质细胞的凋亡等过程[43]。MAPK信号通路包括JNK、p38和ERK三个途径,参与卵母细胞成熟分裂等过程,促进卵泡成熟。

综上所述,二至丸可能通过槲皮素、木犀草素、山奈酚等有效成分,作用于EGFR、ESR1、VEGFA、IL-1β、HIF-1α等靶点,介导AGE-RAGE、PI3K-Akt、MAPK、HIF-1等信号通路发挥抗氧化、抗炎、抑制颗粒细胞凋亡、调节激素水平、促进卵泡发育等作用,改善卵巢功能,发挥“异病同治”治疗肝肾阴虚型MPS及AUB的作用,本研究通过网络药理学方法对二至丸的治疗作用进行初步验证,并经过分子对接进一步证实,以期为临床应用提供理论支持。