马兰草凝胶贴剂对肝硬化腹水大鼠及其活化肝星状细胞凋亡的影响研究

梁光萍 高玲 陈晓兰 张宁 罗乐 李嘉

腹水是肝硬化由代偿期进入失代偿期的典型并发症之一,一旦腹水形成,患者第1年和第5年的病死率分别约为15%和44%～85%[1]。腹水发病机制尤为复杂,与门脉高压、血浆胶体渗透压降低、淋巴液增多、醛固酮系统活性增强等有关[2],其中门脉高压被认为是导致肝硬化腹水形成的始动和关键因素。而在门脉高压中,活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是门脉高压形成的中心环节[3-4],故诱导活化的HSC发生凋亡,是治疗肝硬化腹水的一个重要靶点。

马兰草为菊科植物,民间道地药材,有抗炎、镇痛、保肝等作用,其味辛性寒、凉,有清热解毒、理气消肿、凉血、利湿功效。课题组前期通过临床研究初步发现采用口服健脾活血祛湿方联合马兰草脐灸,能改善肝硬化腹水患者肝功能指标和腹水量,缓解腹胀等[5]。基础研究方面,采用马兰草脐灸治疗肝纤维化模型大鼠能有效改善肝纤维化程度[6-7],且在体外实验中验证了马兰提取物对活化的HSC-T6有促凋亡的功效[8]。鉴于前期研究成果,本研究将马兰草制备成凝胶贴剂,以贴敷脐疗法为干预方法,通过观察肝硬化腹水大鼠的一般情况、腹水量改变、肝组织病理变化、及相关B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2关联X(Bcl-2 associated X,Bax)因子的表达变化,探索治疗肝硬化腹水大鼠可能存在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验环境

60只SPF级健康Wistar雄性大鼠,6周龄,体质量180～200g,购自长沙市天勤生物技术有限公司,合格证号:SCXK(湘)2019-0014。自由饮水饮食,12小时/12小时的光暗循环,环境温度(22±3)℃,相对湿度(50±10)%。

1.2 实验药物

马兰草采摘于贵州毕节,经贵州中医药大学生药实验室田源红教授鉴定为菊科植物马兰[Kalimerisindica(L.)Sch-Bip]的带根全草。称取马兰草粉末200 g(过3号筛),加10倍量70%乙醇回流取3次,浓缩液浓度为0.1 g/mL(以生药计),洗脱剂采用95%乙醇,1 BV/h的速度洗脱,得到纯化物备用。以NP-700(0.009 7)∶甘油(0.548 5)∶纯水(0.347 5)∶Al(OH)3(0.011 0)∶酒石酸(0.003 5)∶薄荷脑(0.013 2)的配比,制备基质,加入13.37 g的马兰纯化物进行配置,充分搅拌均匀,静置30分钟以备用[9]。

呋塞米(20 mg/片,南通制药总厂),螺内酯(20 mg/片,杭州民生药业集团有限公司)。

1.3 主要试剂

四氯化碳(货号C10711535,上海麦克林);橄榄油(货号QS310002012787,上海嘉里食品工业有限公司);水合氯醛(货号A600288-0250)、多聚甲醛(货号A500684)购自上海生工;白蛋白检测试剂盒(货号A020-1,北京雷根);PBS(货号210220,莫纳生物科技有限公司);伊红染色液(货号DH0055)、苏木素染色液(货号DH0001)购自雷根生物;山羊血清(货号C0265)、DAPI染液(货号C1005)、抗荧光淬灭剂(货号P0126)、TritonX-100(货号ST795)、Tunel染色试剂盒(C1089)购自碧云天;Bax一抗(货号A19684,Abclonal);Bcl-2一抗(货号ab182858,美国Abcam)。

1.4 主要仪器

BSA224S型电子分析天平(万分之一)(瑞士Precisa12A公司);RM2235型切片机、HI1220型烤片机、HI1210型展片机(德国Leica);Thermo型微量紫外-可见光分光光度计(美国NanoDrop One/One C);4402型胶体渗透压仪(美国WESCOR);DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂);SP0009-R型外科手术器械包(瑞沃德);HB-RO/60型超纯水仪(美国Millipore);LMQ C-50EP型高压蒸汽消毒灭菌锅(浙江绍兴医疗器械总厂);TCS-SP8型激光共聚焦成像系统(德国Leica);CKK53型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.5 肝硬化腹水大鼠模型建立

将60只健康SPF雄性SD大鼠随机分为空白组(10只)和造模组(50只),适应性喂养1周,参照文献方法[10]空白组大鼠常规饲养,造模组给予腹腔注射CCl4-橄榄油混合液(4∶6)进行造模,饮用水为10%的医用酒精水溶液。根据体质量,除第1天注射剂量按3.0 mL/kg计算,以后每天的剂量为2.0 mL/kg,隔天1次,持续6周。随机抓10只抽取腹水,根据成模标准[11-12]判断是否成功复制肝硬化腹水大鼠模型。

1.6 分组及给药

将40只造模成功的大鼠随机分为模型组、基质组、马兰草凝胶贴剂组、呋塞米+螺内酯组,每组10只。空白组、模型组常规饮食饮水,脱毛抓取,将大鼠放置在大鼠固定器上,固定时间同基质组和马兰草凝胶贴剂组的时间。基质组给予无药物的基质脐贴,两天一次,每次1.5小时,干预持续8周。脐贴贴于大鼠神阙穴,位于大鼠胸腹正中线,胸骨柄上缘至外生殖器连线的上3/4及下1/4交界处[13]。马兰草凝胶贴剂组给予马兰草凝胶贴敷于脐,两天一次,每次1.5小时,干预持续8周。呋塞米+螺内酯组以1∶1混合浓度为0.082 5 mg/mL,灌胃剂量10 mL/kg,两天一次,干预持续8周。

1.7 取材

大鼠末次给药后,禁食12小时,不禁水,腹腔注射10%水合氯醛,以麻醉大鼠。将大鼠仰卧固定于手术台上,延腹中线用手术刀切开,进入腹腔,分离腹主动脉取血5 mL,静置2小时后,4℃ 3 000 r/min离心20分钟,分离血清,-20℃冻存待检,保存备用。每组随机抽取三只大鼠肝脏,在肝右叶离边缘1 cm处,剪取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的组织块,液氮保存。

1.8 指标检测

1.8.1 大鼠一般状态观察 给药期间观察各组大鼠活动情况、精神状态、皮毛润泽度、饮食及大便等一般状态改变。

1.8.2 腹水测量 给药结束后取材时,将大鼠采用10%水合氯醛进行麻醉,剖腹,采用无菌干棉球沾取腹水称量。

1.8.3 大鼠测量白蛋白、胶体渗透压 剥离出腹主动脉,采集血液约5 mL,静置1小时后,4 000 r/min离心10分钟取血清,按照检测试剂盒操作说明书检测血清白蛋白、胶体渗透压水平。

1.8.4 大鼠肝组织病理变化 剪取肝组织,浸泡在4%多聚甲醛中,常规脱蜡、包埋,做石蜡病理切片,用于苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,镜下观察病理切片变化,拍照。

1.8.5 Tunel-α-平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)双标记法检测活化HSC凋亡情况 切取肝组织5 μm置于防脱玻片上,常规石蜡切片脱蜡、复水,双蒸水清洗2分钟×3次。滴加一抗Anti SMA,并放置在湿盒中4℃孵育下过夜。磷酸缓冲盐溶液洗涤3分钟×3次。然后用不含DNase的蛋白酶K,滴加20 μg/mL,放置于37℃烤箱,留置30分钟。磷酸缓冲盐溶液洗滴2分钟×3次。滴加Tunel检测液50 μL,盖上盖玻片。放置于37℃烤箱,留置30分钟,室温避光下孵育60分钟。磷酸缓冲盐溶液洗滴2分钟×3次。DAPI复染,抗荧光淬灭剂封片。放置在显微镜下观察细胞凋亡情况,拍照、采集图像。

1.8.6 免疫荧光法检测Bax和Bcl-2 0.5% TritonX-100,磷酸缓冲盐溶液清洗切片3分钟×3次。封闭切片滴入正常山羊血清,室温60分钟,切片加一抗(1∶200,PBS稀释),置于4摄氏度下过夜。磷酸缓冲盐溶液重复洗涤3分钟×3次,滴加荧光二抗488(1∶300,PBS稀释)37摄氏度60分钟。磷酸缓冲盐溶液浸洗3分钟×3次,滴加一抗(1∶200,PBS稀释),37摄氏度60分钟,滴加荧光二抗488(1∶300,PBS稀释),37摄氏度60分钟,磷酸缓冲盐溶液浸洗3次各3分钟。DAPI核染,放置室温避光15分钟(暗室内进行),再用磷酸缓冲盐溶液重复冲洗4次各5分钟,荧光显微镜下观察各组荧光强度、拍照。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般状态

空白组大鼠活动度大,运动灵活,精神状态佳,皮毛光泽明润,食欲正常,粪便成形;模型组大鼠活动缓慢,精神萎靡,皮毛泽松散,饮食不振,便溏。各治疗组用药后上述表现逐渐好转,尤其马兰草凝胶贴剂组改善明显。

2.2 大鼠腹水量比较

与空白组比,模型组大鼠腹水量明显增加(P<0.01);与模型组比,基质组差异无统计学意义(P>0.05),马兰草凝胶贴剂组和呋塞米+螺内酯组的腹水量均呈明显降低趋势(P<0.01),尤以马兰草凝胶贴剂组的腹水量降低最为明显;与基质组比,马兰草凝胶贴剂组、呋塞米+螺内酯组的腹水量均降低(P<0.01),尤其马兰草凝胶贴剂组的腹水量降低最为显著。见表1。

表1 各组肝硬化腹水模型大鼠腹水量比较

2.3 大鼠血清白蛋白、血浆胶体渗透压水平比较

与空白组比,模型组血清白蛋白、血浆胶体渗透压水平均明显降低(P<0.01);与模型组相比,基质组血清白蛋白水平下降(P<0.05),血浆胶体渗透压水平降低,但无统计学意义(P>0.05),马兰草凝胶贴剂组和呋塞米+螺内酯组血清白蛋白、血浆胶体渗透压水平均明显升高(P<0.01),尤以马兰草凝胶贴剂组升高水平最为明显;与基质组比,马兰草凝胶贴剂组、呋塞米+螺内酯组血清白蛋白、血浆胶体渗透压水平均明显升高(P<0.01),尤其兰草凝胶贴剂组升高最为显著。见表2。

表2 各组肝硬化腹水模型大鼠血清白蛋白、血浆胶体渗透压比较

2.4 大鼠肝组织病理学观察

空白组的肝小叶结构完整、清晰,细胞形态正常,肝血窦未见扩张。模型组肝小叶结构被破坏,假小叶形成,肝细胞出现坏死,炎性细胞浸润,纤维增生明显。基质组可见少量纤维增生,门管区少量炎性细胞浸润。马兰草凝胶贴剂组肝细胞结构接近正常,细胞大小均匀,门管区炎性细胞浸润显著减轻。呋塞米+螺内酯组肝细胞结构、形态恢复近正常,假小叶未见形成。见图1。

注A 空白组;B 模型组;C 基质组;D 马兰草凝胶贴剂组;E 呋塞米+螺内酯组。图1 各组肝硬化腹水模型大鼠肝组织病理切片(HE染色,×200)

2.5 大鼠肝组织活化HSC凋亡情况

图中绿色荧光代表活化HSC表达的α-SMA阳性细胞,红色荧光代表凋亡的Tunel阳性细胞,Merge图中玫红色代表活化的HSC凋亡。结果显示,与空白组比,模型组有少数不明显的Tunel阳性细胞,有许多明显的α-SMA阳性细胞;与模型组比,基质组的α-SMA阳性细胞明显增多,荧光明显增强,Tunel阳性细胞明显增多,马兰草凝胶贴剂组和呋塞米+螺内酯组的α-SMA阳性细胞明显减少,Tunel阳性细胞明显增多,荧光明显增强。与基质组比,马兰草凝胶贴剂组和呋塞米+螺内酯组的α-SMA阳性细胞明显减少,荧光减弱,Tunel阳性细胞增多;与马兰草凝胶贴剂组比,呋塞米+螺内酯组中α-SMA阳性细胞明显增多,荧光明显增强,Tunel阳性细胞增多,表明马兰草凝胶贴剂更能抑制细胞活化,促进活化HSCs凋亡。见图2。

图2 各组肝硬化腹水模型大鼠肝组织活化HSC凋亡情况(Tunel-α-SMA法,×200)

2.6 大鼠肝组织Bax、Bcl-2蛋白表达情况

与空白组比较,模型组Bcl-2、Bax表达量显著升高,荧光显著增强;与模型组比较,基质组Bcl-2、Bax表达量均降低,荧光减弱,马兰草凝胶贴剂组和呋塞米+螺内酯组的Bcl-2表达量降低,荧光减弱,Bax表达量明显升高;与基质组比,马兰草凝胶贴剂组、呋塞米+螺内酯组Bcl-2表达量降低,荧光减弱,Bax表达量明显升高,其中马兰草凝胶贴剂组Bax表达量升高最为显著。见图3。

3 讨论

肝硬化是受一种或者多种因素(病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎)的反复影响而发展而来的慢性、进行性肝病,预后不良,并发症多,其中腹水是肝硬化晚期进入失代偿期的典型并发症之一。目前认为门脉高压是肝硬化腹水发病机制的始动因素[14],活化的HSCs在门脉高压中占据主导作用[15],故诱导活化的HSCs凋亡是治疗肝硬化腹水的有效策略。HSCs位于Disse腔中,呈梭形、多边形,形态不规则。肝脏未受炎症物质及外界刺激时,HSCs处于静止的状态,不表达α-SMA,当肝脏被刺激时,静态的HSCs被激活,高表达α-SMA,使HSCs收缩力增强,肝内压力变大,静脉压力增高[16]。本研究结果显示,马兰草凝胶贴剂组的α-SMA阳性细胞结果表达明显减少,荧光减弱,Tunel阳性细胞增多,提示马兰草凝胶贴干预能有效地引起活化的HSCs产生凋亡,对肝硬腹水大鼠治疗有效。

Bcl-2家族由促凋亡(或细胞死亡)和抗凋亡(或细胞存活)基因组成,正是这些基因谱系之间的表达平衡决定了细胞的死亡或存活,Bcl-2家族分子分为Bcl-2(抗凋亡蛋白)、Bax(促凋亡蛋白)[17-18]。促凋亡、抗凋亡与Bax/Bcl-2比值密切联系,Bax蛋白表达量升高,Bcl-2蛋白表达量降低,比值升高,可促进细胞凋亡,反之起抑制细胞凋亡作用。有研究表明[19],在新型孕烯醇酮衍生物通过Bcl-2家族基因调控肝癌细胞凋亡的体外研究中发现,通过提高Bax/Bcl-2比值,能诱导细胞凋亡。本研究发现马兰草凝胶贴剂组能显著升高Bax表达,降低Bcl-2表达,表明马兰草凝胶贴能有效促进活化HSCs产生凋亡,改善肝硬化腹水。

肝硬化腹水属于中医学“积聚”“鼓胀”“胁痛”“黄疸”的范畴,主要病因有饮食不节、七情、过度劳欲等,病机与肝、脾、肾三脏功能失调密切相关,表现为肝失疏泄,脾失健运,肾失开阖,致气、血、瘀、水积于腹中[20]。本病的治疗应采用疏肝理气、健脾助运,温肾阳以开阖的治疗原则,达行气活血、散瘀消肿的功效。

中医贴敷脐疗法发挥药、穴位、经络联合作用,可起到疏通全身气血、温通经脉、活络散瘀的功效。贴敷脐疗法又被称作“脐疗法”,将药物于贴敷神阙穴处,神阙穴与五脏、六腑、全身经络密切联系,主司百脉[21]。且在胚胎发育过程当中,脐作为腹壁的最后的闭合之处,该处无脂肪组织,角质层菲薄,是多条经脉循行之地,有众多静脉网和动脉分支经过,因此使其具备吸收力强、迅速,生物利用度高的特点,药物通过脐快速疏布至全身[22]。

患有腹水的患者免疫力都大幅度减低,从细胞水平上进行剖析,通过刺激神阙穴,能起到激活机体免疫系统、提高免疫功能作用[23]。马兰草为菊科马兰的全草,是一种药食同源的植物,具有丰富的营养价值,化学成分主要包括萜、有机酸、糖苷、酚类等化合物,药理效应有保肝、抗氧化、抗肿瘤、抗炎[24]。有研究显示[25],马兰草治疗肝病疗效确切,具有一定的预防和治疗作用。课题组前期研究发现马兰草脐灸能改善肝硬化腹水大鼠的一般状态,消退腹水。本研究结果显示,马兰草凝胶贴剂可改善大鼠一般状态,显著降低大鼠腹水量,升高血清白蛋白、血浆胶体渗透压水平,病理检测见微量炎性细胞、细胞变性减少、细胞大小均匀,提示马兰草凝胶贴剂能有效促进腹水的消退,缓解腹胀,增加肝脏的供血量,修复肝组织病理形态,减轻肝细胞损伤。

综上所述,马兰草凝胶贴剂能有效治疗肝硬化腹水大鼠,其作用可能机制与修复肝组织病理形态和促进活化的HSCs凋亡有关。