补脾养心方对心脾两虚证失眠小鼠补益心脾及改善睡眠的研究

廖艳 热依拉·吐尔逊 高鑫 乐娜 刘冰清 杨彩玲 张建军 田世民 王淳

《中国失眠障碍诊断和治疗指南》显示[1],失眠是睡眠障碍的一种,其特征为频繁而持续的入睡困难或睡眠维持困难并导致睡眠满意度不足,长期睡眠障碍易出现疲劳、精神萎靡、情绪不稳等症状。在我国,失眠的发病率高达30%[2],目前对其根治仍无较好措施。中医在调理失眠特别是早期失眠即亚健康失眠方面具有独特优势[3]。辨证思想是中医药的精髓,中医认为,思虑伤脾、暗耗心血,心神失养诱发的心神不安是失眠的常见类型,治则多以养血安神,补益心脾为主[4]。因此,本研究拟选择失眠常见的中医证候心脾两虚证[5],复制心脾两虚亚健康失眠小鼠模型,在临床经验方“补脾养心方”(酸枣仁、茯苓、灵芝、刺五加、五味子)的基础上[6],探讨该方对于心脾两虚亚健康失眠小鼠的补益心脾功效和睡眠改善作用,为后续辨证保健应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性昆明小鼠60只,体质量18～22 g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证编号:SCXK(京)2019-0010。动物饲养于SPF级动物房,给予小鼠普通饲料,自由饮水,室温(22±2)℃,相对湿度为60%～70%,灯照周期为12小时。实验通过北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审查,符合相关伦理学要求。

1.2 实验药物

酸枣仁(批号:19062705)、灵芝(批号:20170101)、刺五加(批号:180605002)、茯苓(批号:20071901)、五味子(批号:18101102)、人参归脾丸(批号:20035001)均购自北京同仁堂;戊巴比妥钠(上海伊卡生物技术有限公司,批号:20170611)、巴比妥钠(北京虹湖联合化工产品有限公司,批号:570471)、盐酸普萘洛尔片(江苏亚邦爱普森药业有限公司,批号:1703098)。

1.3 实验仪器

定制玻璃游泳箱(规格:75 cm×55 cm×40 cm)、离心机(德国Eppendorf)、全自动生化仪(UZS-300X)、电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)、电子秤(赛多利斯科学仪器北京有限公司)、制冰机(松下冷链大连有限公司)、冷冻切片机(CryoStar NX50)、超分辨显微组织成像系统(Leica)。

1.4 补脾养心方的制备

补脾养心方用药组成为酸枣仁、灵芝、刺五加、茯苓、五味子,因该方目前在专利申请阶段,故本文暂略去其剂量及比例,但根据文献[6]换算后小鼠灌胃低、中、高剂量的浓度分别是:0.15 g/mL,0.3 g/mL,0.6 g/mL。取5倍处方量药材,加水(10倍药材量)(V1),浸泡12小时过夜。滤出浸泡液,测定体积(V2),计算吸水倍数。再加水至药材完全浸没,测定体积(V3),计算加水倍数。

加水10倍量,浸泡1小时,煎煮3次,每次45分钟,合并滤液,沸腾浓缩至120 mL,使药液含药量达到0.6 g/mL。将120 mL浓缩药液分成3份,分别为65 mL、35 mL、20 mL。取35 mL药液加水35 mL,使药液含药量变为0.3 g/mL,得到70 mL含药量0.3 g/mL的药液,即中剂量组药液。取20 mL药液加水60 mL,使含药量变为0.15 g/mL,得到80 mL含药量0.15 g/mL的药液,即低剂量组药液。每周煮药1次,共4次。

1.5 人参归脾丸药液的配制

阳性对照药为人参归脾丸,每丸重9 g,根据文献数据[4],小鼠给药浓度为0.5 g/mL。

1.6 分组与给药方法

将60只雄性昆明小鼠适应性喂养7日后,随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(5 g/kg)、补脾养心方低(1.5 g/kg)、中(3 g/kg)、高剂量组(6 g/kg),每组10只。每日上午给予空白对照组小鼠生理盐水,其余各组给予相应剂量的药物,灌胃剂量0.1 mL/10 g,根据体质量变化调整灌胃量,连续给药30天。灌胃第27～30天,空白对照组每日下午给予生理盐水,其余各组给予盐酸普萘洛尔溶液1.5 mg/100 g,灌胃剂量0.1 mL/10 g,每日1次,连续4日。

1.7 体质量与摄食量测定

于实验开始第1天、第14天、第21天、第28天记录各组小鼠体质量,观察给药后各组小鼠体质量变化;于实验第1天、第14天、第28天称量各组小鼠24小时内摄食量。

1.8 胸腺、脾脏指数测定

实验第30天,各组小鼠眼球取血后,立即剖腹称取胸腺和脾脏,计算胸腺、脾脏指数。

1.9 睡眠时间和睡眠潜伏期的测定

通过预实验判定末次给药后各组小鼠腹腔注射55 mg/kg戊巴比妥钠、30 mg/kg戊巴比妥钠(最大阈下催眠剂量)、300 mg/kg巴比妥钠,注射量均为0.1 mL/10 g,测定小鼠翻正反射,超过60秒仍无法翻正,则为进入睡眠并记录各组小鼠入睡动物数,以此观察小鼠对直接睡眠实验、戊巴比妥钠睡眠实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验和巴比妥钠睡眠潜伏实验的影响。

1.10 力竭负重游泳时间和悬尾不动时间测定

力竭负重游泳从灌胃开始的第16日起,灌胃给药结束1小时后,除空白对照组外,其余各组进行负重力竭游泳运动,首先计算各组小鼠体质量的5%作为负荷重量,并制作相应剂量的铅块,实验开始前,将对应的铅块固定在小鼠尾部,随即将小鼠放入定制的游泳箱内,水温(20±5)℃,水深25 cm,确保小鼠掉入水中时尾巴不能接触到游泳箱底部。每箱放入2只,从小鼠进入游泳箱内开始计时。

力竭游泳的判断标准:小鼠运动失调,头部无法浮出水面,并且沉入水底超过5～8秒无法上浮。此时立刻将小鼠捞出水面,记录力竭游泳时间;同时将小鼠放入平坦桌面,开始记录小鼠悬尾不动时间。

1.11血清指标测定实验结束后,各组小鼠过夜禁食16小时,称重并处死。迅速眼球取血,血液样本静置2小时后,离心取上清进行谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌酸激酶(creatine kinase,CK)含量检测。

1.12小鼠心肝脾和肌肉组织病理学检查实验结束后,各组小鼠过夜禁食16小时,称重并处死。迅速采集肝脏、心脏组织、脾脏、肌肉组织样本。取相同部位心、肝、脾、肌肉组织,甲醇固定24小时脱水,石蜡包埋,切片后苏木素—伊红(HE)染色,400倍光镜下观察心、肝、脾、肌肉组织形态变化。

2 结果

2.1 对体质量的影响

实验第14天、21天和28天,与空白对照组比较,模型组体质量明显下降;与模型组相比,阳性对照组、补脾养心方低、中、高剂量组体质量明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

表1 补脾养心方对各组小鼠体质量的影响

2.2 对摄食量的影响

实验第14天,与模型组相比,阳性对照组小鼠摄食量增加;实验第28天,与空白对照组比较,模型组小鼠摄食量明显减少;与模型组相比,阳性对照组、补脾养心方低、中、高剂量组摄食量明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

表2 补脾养心方对各组小鼠摄食量的影响

2.3 对力竭游泳时间和悬尾不动时间的影响

与空白对照组比较,模型组小鼠力竭游泳时间明显缩短,悬尾不动时间明显延长;与模型组相比,阳性对照组、补脾养心方低、中、高剂量组小鼠力竭游泳时间明显延长,悬尾不动时间明显缩短,差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表3。

表3 补脾养心方对各组小鼠力竭游泳和悬尾不动时间的影响

2.4 对胸腺指数、脾脏指数的影响

与空白对照组比较,模型组小鼠胸腺指数和脾脏指数均有明显下降;与模型组比较,阳性对照组、补脾养心方低、中、高剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数均有提高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结果见表4。

表4 补脾养心方对各组小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响

2.5 对睡眠的影响

在直接睡眠行为学实验中,各组小鼠均无产生直接睡眠(P>0.05)。与空白对照组相比,模型组睡眠时间明显缩短,并延长了睡眠潜伏期;与模型组相比,阳性对照组和补脾养心方低、中、高剂量组均延长了睡眠时间,缩短了睡眠潜伏期,发生了阈下剂量的睡眠行为,差异均有统计学意义(P<0.05)。结果见表5。

表5 补脾养心方对各组小鼠睡眠的影响

2.6 对血清ALT、AST、ALP的影响

与空白对照组比较,模型组小鼠ALT、AST、ALP含量明显升高;与模型组比较,阳性对照组、补脾养心方低、中、高剂量组的ALT、AST、ALP含量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表6。

表6 补脾养心方对各组小鼠血清ALT、AST、ALP的影响

2.7 对血清CK、LDH的影响

与空白对照组比较,模型组小鼠CK和LDH含量明显升高;与模型组比较,阳性对照组、补脾养心方低、中、高剂量组小鼠CK和LDH均降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表7。

表7 补脾养心方对各组小鼠血清CK、LDH的影响

2.8 对小鼠心、肝、脾、肌肉组织的影响

2.8.1 对小鼠心脏组织的影响 与空白对照组相比,模型组细胞间隙增大,部分线粒体形态结构不完整;阳性对照组、补脾养心方低、中、高剂量组细胞间隙正常,心肌纤维排列整齐,阳性对照组和补脾养心方高剂量组改善更明显。详见图1。

注A 空白对照组;B 模型组;C 阳性对照组;D 补脾养心方低剂量组;E 补脾养心方中剂量组;F 补脾养心方高剂量组。图1 补脾养心方对各组小鼠心脏组织的影响(HE,×400)

2.8.2 对小鼠肝脏组织的影响 与空白对照组比较,模型组肝细胞密集、体积缩小,核密度增大,细胞间隙大,双核细胞增多,细胞质中出现空泡。与模型组相比,阳性对照组、补脾养心方低、中、高剂量组小鼠肝细胞形态趋于正常,细胞圆润,细胞间隙明显缩小,空泡和双核细胞出现较少,阳性对照组和补脾养心方高剂量组改善更明显。详见图2。

注A 空白对照组;B 模型组;C 阳性对照组;D 补脾养心方低剂量组;E 补脾养心方中剂量组;F 补脾养心方高剂量组。图2 补脾养心方对各组小鼠肝脏组织的影响(HE,×400)

2.8.3 对小鼠脾脏组织的影响 与空白对照组相比,模型组红白髓分界不清晰,结构不完整,出现紊乱,呈现出散在的小团状;与模型组比较,阳性对照组、补脾养心方低、中、高剂量组脾脏红白髓界限逐渐清晰,结构完整,呈现出完整的形状,淋巴细胞密度增大。详见图3。

注A 空白对照组;B 模型组;C 阳性对照组;D 补脾养心方低剂量组;E 补脾养心方中剂量组;F 补脾养心方高剂量组。图3 补脾养心方对各组小鼠脾脏组织的影响(HE,×400)

2.8.4 对小鼠肌肉组织的影响 与空白对照组相比,模型组小鼠肌肉组织染色改变,肌纤维间隙增大,出现部分炎性细胞浸润;与模型组相比,阳性对照组、补脾养心方低、中、高剂量组小鼠肌纤维间隙明显缩小,炎性细胞较少,肌纤维排列趋于整齐。详见图4。

注A 空白对照组;B 模型组;C 阳性对照组;D 补脾养心方低剂量组;E 补脾养心方中剂量组;F 补脾养心方高剂量组。图4 补脾养心方对各组小鼠肌肉组织的影响(HE,×400)

3 讨论

失眠证又称“不寐”。中医学认为,不寐的总体病机可概括为阴阳失交,脏腑气血功能失调[7-9]。心脾两虚,本在脾虚,脾胃为气血生化之源,心主血脉、主神志,若气血生化乏源,则无以濡养心神,心神失养而进一步导致失眠[10]。现代临床研究中,心脾两虚证常表现为乏力、疲劳、心悸等,故治则多以补益心脾、宁心安神为主[11]。基于对1081例诊断为失眠患者的诊疗信息进行整合,发现失眠患者多以虚证为主,尤以心脾两虚证居多[5]。故本研究结合中医辨证论治及辨证保健的思想[12],并在前期组方“补脾养心方”的基础上[6],探讨该方对心脾两虚亚健康失眠小鼠补益心脾和改善睡眠的作用。

补脾养心方由酸枣仁、灵芝、茯苓、刺五加、五味子组成。其中酸枣仁和灵芝酸甘化阴,滋肝血以调畅情志,补心气以安神助眠;茯苓利水渗湿以健脾宁心;刺五加补益心脾,益气养血;五味子酸温,敛心气,助酸枣仁、灵芝、茯苓健脾宁心。据《中成药辞典》[13]和《卫生部药品标准中药成方制剂》第四册[14]记载,人参归脾丸处方来源于《济生方》中归脾汤,适用于思虑过度、心脾两虚所致的心悸怔忡、失眠健忘等,故选择具有益气补血、健脾养心功效的人参归脾丸作为阳性对照药进行本次研究。

目前的失眠模型多使用氯苯丙氨酸诱导[15],其优势在于操作方便、耗时短且成功率较高,但该诱导更偏向于评价疾病状态。李贵海[16]使用多平台水环境法建立睡眠剥夺大鼠模型,探究养心安神法对其改善睡眠作用;徐立等[17]用每日负重游泳+实验后四天灌服心得安溶液、皮下注射利血平建立心脾两虚失眠模型。本实验在上述模型研究的基础上,结合亚健康失眠人群特点,基于已有文献[18],使用行为学与灌服心得安药物的方式复制心脾两虚亚健康失眠小鼠模型开展研究。

心脾两虚证候评价要素中,小鼠一般状态、体质量和摄食量是其评价体系中常用的生理状态指标。灌胃一周至两周后,模型组小鼠体质量开始下降,摄食量减少,提示模型组小鼠表现出心脾两虚证候的指征。力竭游泳时间和悬尾不动时间这两项行为学实验也是评价心脾两虚的有力指标[19]。《素问·痿论篇》云:“脾主身之肌肉[20]。”即脾气健运,则肌肉丰盈而有活力,反之则肌肉痿缩不用。汉代张仲景提出:“虚劳虚烦不得眠。”本研究中模型组小鼠力竭游泳时间明显缩短且其悬尾不动时间延长,符合脾虚证候的判别要素。此外,模型组小鼠心脏组织出现少量炎症改变,肝脏组织细胞体积缩小,脾脏组织分界模糊,肌肉组织肌纤维断裂等病理学改变。综上,通过基本生理指标、行为学和病理学分析,表明本实验所复制的模型小鼠具备了心脾两虚证候特征。

研究表明,LDH和CK是与睡眠相关的生物标记物[21]。CK、LDH常用作心肌能量代谢以及骨骼肌损伤和修复的重要标志。本研究中模型组小鼠CK和LDH升高,提示CK和LDH可能在改善睡眠和心脾两虚证候中起着重要的调节作用。胸腺和脾脏是重要的免疫器官,可以直接反映机体的免疫力[22],正常的睡眠—觉醒周期又高度依赖于机体免疫系统的调节功能[23]。模型组小鼠脾脏和胸腺指数降低,提示其免疫功能下降,也反映其睡眠状态不佳和心脾两虚的证候。

本研究探讨了补脾养心方对心脾两虚失眠小鼠的补益心脾作用,相比模型组,补脾养心方低、中、高三个剂量组和阳性对照组小鼠力竭游泳时间明显延长,悬尾不动时间缩短;心、肝、脾、肌肉组织病理变化均有所好转,表明心脾两虚症状明显改善,且补脾养心方可以延长睡眠时间、缩短睡眠潜伏期,降低戊巴比妥钠阈下剂量,提示对小鼠睡眠情况也有所改善。此外,补脾养心方三个剂量组均能下调血清中ALT、AST、ALP含量,使其趋于正常水平,提示可能有一定的保肝作用且安全性较好。另外,相较于人参归脾丸,补脾养心方药味精简,无明显禁忌人群,且安全性和适用性良好。

综上,补脾养心方对心脾两虚亚健康失眠小鼠具有良好的补益心脾功效和改善睡眠作用,为其后续的辨证保健研究及中医对亚健康健康管理模式[24]提供了实验基础,但该方改善睡眠的可能作用机制还有待深入研究。