炎性细胞因子对肺血管内皮细胞与肺成纤维细胞三维立体培养基质金属蛋白酶2的影响

李超然,闫 蕾,王 惠,王学锷,芦 莎,谢琳霞,王 青,朱运奎,于 军,Ronald F Ertl(美国)

(1.西安国际医学中心医院呼吸与危重症医学三科,陕西 西安 710100;2.西安国际医学中心医院临床实验中心,陕西 西安 710100;3.美国内布拉斯加州大学医学中心重症医学部,内布拉斯加州 奥马哈 72662)

新型冠状病毒(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)感染引起的重症型肺炎,发病机理是机体免疫系统在病毒入侵后被激活,释放多种炎性细胞因子,引发细胞因子风暴(Cytokine storm),造成内皮细胞、上皮细胞及细胞间质损伤,毛细血管渗漏,继而发生肺水肿,呼吸衰竭[1-6]。在诸多的细胞因子中,目前已知白细胞介素-6(Interleukin6,IL-6),肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β),γ干扰素(γInterferon,INFγ) 等是最主要的炎性介质[1-5]。中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)也参与了肺损伤[ 7]。但细胞因子损伤机制仍不完全清楚。肺泡间质是维持肺泡结构完整和功能正常的重要成分,因此细胞因子损伤肺组织的可能机理脂之一,是通过诱导基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase system,MMPs)直接参与肺泡组织细胞外基质降解[8-11],从而损伤肺泡组织。MMPs在TNF-α,IL-1β等炎症因子刺激下大量产生,直接作用于肺间质,降解基质,破坏血管内皮和肺泡上皮的完整性,通透性增加,血管内液体渗出至组织间隙以及肺泡内,造成肺泡和间质水肿,这是ARDS的病理基础[12-14]。临床观察到,重症COVID-19肺部感染后,常继发肺纤维化,其原因为修复过程中组织不适当的重塑所致。在组织修复重塑过程中,MMPs作用至关重要[13]。本研究旨在建立肺血管内皮细胞(Human pulmonary mircovascular endothelia cells,HPMEC )-肺成纤维细胞(Human fetal lung fibroblasts,HFL)-Ⅰ型胶原组成的三维立体(Three dimentional culture,3D)培养模型,模拟肺泡血管内皮和间质层结构,以IL-6、IL-1β、TNF-α和中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil ealtase, NE)分别进行刺激后,观察组织细胞MMP2分泌变化,观察哪些细胞因子可以诱导MMP2产生,从而探讨细胞因子诱导MMPs肺损伤机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 细胞培养液DMEM和 DMEM/F12购自gibco(中国上海公司);鼠尾Type I Collagen 购自Discovery Lab ware公司; TNF-α 购自Gibco(中国上海公司);IL-6,IL-1β,购自Thermofisher (中国上海公司);NE购自 Bivision USA(中国上海公司)。HFL购自BNCC(中国上海细胞),HPMEC购自BNCC(中国上海细胞)。得到原代培养细胞后进行传代培养,用第4～8代细胞进行三维立体培养。所有细胞培养材料购自NEST(西安博达公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 HFL和HPMEC三维立体混合培养模型:培养细胞用胰酶消化后移除含血清培养基,加入无血清培养基DMEM/F12,细胞稀释成为5×105/ml细胞悬液8 ml,在冰盒低温条件下进行操作。依次按比例1∶20∶5加入0.1mol/L NaOH 0.08 ml,5%Ⅰ型胶原1.52 ml,5×DMEM 0.4 ml, 混匀,最终使DMEM为×1浓度,pH为7.4,最后加入含HFL的无血清DMEM细胞混悬液8 ml,使胶原浓度为0.75 g/ml,使细胞浓度为4×105/ml。混匀后以每孔0.5 ml含HFL的胶原溶液分配至24孔培养板内,放置于37 ℃培养箱内30 min,三维立体半固体胶原形成。于胶原孔上面内加入含HPMEC的无血清DMEM混悬液(细胞浓度为4×105/ml)1 ml。待内皮细胞完全贴附于立体胶原上面后,培养液中加入不同细胞因子(TNF-α 20 ng/ml,IL-1β10 ng/ml,IL-6 20 ng/ml,或NE 2 ng/ml),放置在37 ℃培养箱内(5% CO2)进行培养。每天观察细胞在胶原内生长状况,3 d后,收集培养上清液,备明胶酶谱检测用。

1.2.2 明胶酶谱法制备:用明胶溶液制成3%明胶凝胶膜,标本槽内加入25 μl上述标本/缓冲液,在120 V电压下电泳约3 h,取出凝胶,以2.5% Triton ×100进行脱洗,然后加入含锌、钙的孵育液,摇床内37 ℃放置12 h过夜。用考马斯亮蓝进行染色和脱色,取得理想条带凝胶,照相分析。

2 结 果

2.1 3D培养下HFL和HPMEC的形态变化 三维立体培养条件下,HFL单独或混合培养条件下,生长在胶原内以三维方向伸开,呈条索状、网状(图1A、C);HPMEC在胶原面上生长,基底部植于胶原基质,上部暴露于培养液,镜下观察到HPMEC呈椭圆状伸展于胶原内,趋于形成环状,生长良好且有明显增殖(图1B、D)。混合3D培养时,可以看到HFL和HPMEC共存的状态(图1C、D)。

注:A为三维立体混合培养中HFL位于胶原内,呈条索状,三维分布呈网状结构; B为三维立体培养中HPMEC,胞体较短嵌于胶原,呈环状分布;C为HFL和HPMEC混合三维立体培养中的HFL,通过变焦观察表面和深部细胞状态,HFL的基本形态和单独培养时相似,混合培养时与血管内皮细胞交织共存;D为混合3D培养时的HPMEC呈现良好生长状态,较起初时细胞密度增加,也呈环状分布,表层也可看到成纤维细胞,深层则以成纤维细胞为主,血管内皮细胞不向胶原深部生长图1 HFL、HPMEC单独或混合3D培养细胞形态

2.2 两种不同细胞单独或混合3D培养时MMP2变化 HPMEC与Ⅰ型胶原 3D培养,细胞数为4×105/ml。培养液为无血清DMEM,3 d后收集培养液,制备明胶酶谱检测MMP2,结果显示,单独HPMEC 3D培养时MMP2的分泌量极少(图2)。HFL与Ⅰ型胶原3D培养,细胞数为4×105/ml。培养液为无血清DMEM,3 d后收集培养液,制备明胶酶谱检测MMP2。结果显示,HFL单独3D培养中,能分泌较多的MMP2(图3)。HPMEC/HFL以不同细胞浓度组合进行3D混合培养,+表示该细胞为常规数量4×105/ml,1/4、1/2, 2×,4×表示该细胞数量为常规的倍数;培养液为无血清DMEM,3 d后收集培养液,制备明胶酶谱检测MMP2。结果显示,HPMEC数量不变,随着HFL数量的增加,MMP2的分泌量相应增加(图4)。HFL数量不变,HPMEC数量增加,MMP2的产量没有明显变化(图4)。以上实验证明,在混合3D培养条件下,MMP2主要由HFL产生,HPMEC只产生极微量MMP2。

注:M为标准分子蛋白标记 ;72 kDa 为MMP2图2 单独HPMEC 3D培养时MMP2的表达

注:M为标准分子蛋白标记;72 kDa 为MMP2; 82 kDa 为MMP2 前体图3 单独HFL3D培养时MMP2的表达及其细胞因子对MMP2的影响

注:M为分子量蛋白标准;72 kDa为MMP2图4 HPMEC/HFL混合3D培养不同细胞数时MMP2的表达

2.3 细胞因子对MMP2的影响 单独HFL 3D培养时,可以产生一定量的MMP2,TNF-α,IL-1β可以诱导HFL产生更多MMP2,条带明显增加,但IL-6促进HFL产生MMP2的作用不明显(图3)。NE具有较强的诱导MMP2产生的作用,条带明显增宽(图3);如果联合TNF-α或IL-1β,诱导产生更多MMP2,3种细胞因子与NE联合均明显增宽MMP2的条带(图3)。但在单独HPMEC 3D培养时,各种细胞因子均不能诱导产生更多的MMP2(图2)。HPMEC/HFL(4×105/ml)进行3D混合培养,在无血清DMEM培养液中分别加入TNF-α(10 ng/ml)、IL-1β(5 ng/ml)、NE(2 μmol),然后在3种炎性因子刺激的基础上再加入IL-6(20 ng/ml),3 d后收集培养液,制备明胶酶谱检测MMP2,结果显示,IL-1β、TNF-ɑ、NE 均可诱导MMP2的产生,IL-6则无明显诱导增强作用(图5),即使加倍剂量亦不能(图6)。若先加入TNF-α(10 ng/ml)、IL-1β(5 ng/ml)、IL-6(20 ng/ml),再将NE(2 μmol)加入已有其他炎性细胞因子的培养液中,结果显示NE加入使MMP2得分泌量显著增加,且与TNF-ɑ、IL-1β有协同作用(图7)。试验证明TNF-α、IL-1β、NE均可诱导HFL产生更多MMP2,尤其NE作用更为明显,不同炎症因子联合作用时效果更佳,IL-6不具备诱导HFL产生MMP2的作用。

注:M为分子量蛋白标准;82 kDa为 MMP2前体;72 kDa为MMP2;54 kDa为MMP2活化部分图5 不同细胞因子对HPMEC/HFL3D混合培养下MMP2表达的影响

注:M为分子量蛋白标准;72 kDa为MMP2图6 不同浓度IL-6对HFL/HPMEC混合3D培养下MMP2表达的影响

注:M为分子量蛋白标准; 72 kDa为MMP2;82 kDa为MMP2 前体图7 NE对HPMEC/HFL混合3D培养时MMP2表达的影响

2.4 NE对HPMEC/HFL混合3D培养时MMP2的影响 HPMEC/HFL混合3D培养,在不同条件下再加入NE,均可使MMP2条带增宽,与TNF-α 和IL-1β共同刺激下能产生更多MMP2,且活化条带增加,IL-6不增加MMP2,但NE与IL-6共同作用,MMP2条带明显增厚。表明NE可以诱导HFL 产生MMP2,也有促进其活化作用(图7)。

3 讨 论

本研究设计模拟肺泡毛细血管和间质结构,将肺微血管内皮细胞培养于肺成纤维细胞和Ⅰ型胶原三维立体培养胶上,形成微血管内皮细胞、成纤维细胞、基质胶原共同构成的3D模型,在不同细胞因子刺激下,观察了MMP2的诱导与活化。通过单独内皮细胞培养、内皮细胞和成纤维细胞呈比例增减的试验,发现内皮细胞只能生成微量的MMP2,在细胞因子刺激下也不能诱导内皮细胞产生更多的MMP2,这可能与其结构功能相适应。在病理性损伤中,如果内皮附着的基质完好,损伤较轻也容易修复,如果基质部分被降解破坏,证明损伤严重,就会出现严重的毛细血管渗漏[6]。

本研究表明,在内皮细胞与成纤维细胞混合3D培养模型中,肺成纤维细胞是生成MMP2的主要组织细胞。这与其支撑维持基质结构和重塑功能相关。正常状态下,成纤维细胞能产生一定量的MMP2,用于维持基质成分的降解更新。当遇到细胞因子风暴后, 在TNF-α,IL-1β等细胞因子刺激下,产生大量的MMP2,同时还会诱导产生过量的其他MMPs,降解更多的基质成分[8-13], 尤其是支撑毛细血管壁的基质胶原成分,进而加重附着在基质的内皮和上皮细胞损伤,发生急性肺损伤、肺泡水肿、急性呼吸窘迫综合征(ADRS)[12-14]。肺成纤维细胞参与炎性细胞因子肺损伤的作用需要高度重视和进一步研究。

采用盲肠结扎坏死诱导的脓毒症模型中发现,IL-6、IL-10、TNF-α,MCP-1 等细胞因子显著升高,参与急性肺损伤[15]。细胞因子风暴在各种急性严重感染所致的脓毒症病理过程中,参与组织损伤、引起器官功能障碍和衰竭,是致病的关键因子。但是,细胞因子是如何损伤组织和细胞的机理极为复杂,不同细胞因子作用途径不同,细胞因子之间也有协同或抑制的机制。基质金属蛋白酶损伤机理是直接降解维持组织结构完整的基质成分,从而造成组织破坏损伤[12]。本研究探讨了细胞因子风暴中,哪种细胞因子可诱导MMP2。结果证明TNF-α、IL-1β是诱导MMP2最主要的细胞因子,与以前作者的研究以及文献报告一致[16],TNF-α、IL-1β可以诱导肺成纤维细胞和支气管平滑肌细胞产生大量MMP1,2,3,9,导致三维立体培养的胶原大量降解。如果这种情况出现在肺泡,肺泡基质被降解,通透性增加,肺泡会发生严重损伤。在临床,IL-1β和TNF-α并没有得到高度重视,不是常规检测因子,也没有列为重症肺炎检测的预警指标。在新冠病毒感染和脓毒症临床研究中发现,IL-6是重要的促炎因子,是多效性细胞因子,可能通过促进浆细胞存活、促炎性T淋巴细胞的分化和激活,分泌更多的TNF-α、IL-1β,在MODS病理生理学中发挥多重作用[17]。IL-6可激活T细胞,大量产生更多炎性细胞因子,从而形成炎症风暴,导致严重肺部和其他器官的免疫损伤[3-4]。本研究证明,IL-6不能直接诱导成纤维细胞产生MMP2,其对MMP2的作用可能是通过诱导T细胞产生TNF-α和IL-1β从而诱导MMPS间接损伤肺泡组织。与IL-6不同,炎性细胞因子IL-1β、TNF-α可以直接上调成纤维细胞MMP2表达,导致基底膜胶原和细胞外基质的降解,引发组织通透性渗出、水肿,在这一病理机制中占主导作用。

继发于新冠病毒感染的肺纤维化发病率高达44.9%[17-18],比特发纤维化的发病率还要高,因为新冠病毒感染人口基数巨大,发生纤维化的绝对数也多,值得高度重视和深入研究。临床观察到细胞因子风暴的强弱与新冠肺炎疾病严重程度相关,而新冠肺炎病情严重程度与继发纤维化相关,病情越重,纤维化发生率越高,纤维化程度也越严重[19-20]。研究也表明,肺纤维化与MMPs活性直接相关[18]。在炎症期,MMPs主要降解基质。在损伤修复期,MMPs参与组织重塑,如果重塑失控,就会导致纤维化。纤维化的肺组织内胶原沉积增厚,成纤维细胞增值,胶原浓度增加,肺泡组织收缩变小,间隔变厚,弹性变差,影响气体交换,出现低氧血症和呼吸衰竭。临床观察到,继发于新冠肺炎的间质性肺纤维化有部分可逆性,说明重塑功能正常时,组织结构可以进行重构,重构过程首先需要把过多、过厚的纤维基质降解,然后重新构建肺泡组织。降解过程主要依赖于基质金属蛋白酶的产量和活性。所以在肺纤维化病理过程中基质金属蛋白酶的作用至关重要。基质金属蛋白酶是一个庞大的家族,约有二十余种不同结构的MMPs,不同MMPs的作用机制基本相同,降解基质成分。但不同MMPs,针对的降解成分有所不同,MMP2主要是降解基质中最重要的成分-胶原,其活性在许多疾病中起重要作用。

本研究建立的HFL与HPMEC在Ⅰ型胶原三维立体培养体外模型,模拟细胞因子损伤时MMP2的产生细胞来源主要是HFL、HPMEC产生的MMP2量很少,对细胞因子诱导反应也不强,表明组织损伤时产生的MMP2主要来自间质细胞。基质组织的成分的合成与降解主要由成纤维细胞分泌的MMPS调控。风暴细胞因子中IL-6的作用通过调控其他炎性介质损伤肺组织,因为它是最早由炎细胞产生的促炎因子。

本研究通过HFL与MPEC 3D培养模型证实,作为细胞因子风暴的重要成分,TNF-α、IL-1β及NE能诱导组织细胞HFL分泌更多的MMP2,在此模型IL-6不诱导HFL分泌MMP2,其损伤机制可能是通过诱导IL-1β、TNF-α参与肺泡组织基质的降解损伤,HPMEC不能被细胞因子诱导产生更多MMP2。MMPs既是急性肺损伤形成的基础,又是形成肺间质纤维化的关键组织蛋白酶。

在新冠病毒感染的重症患者,继发肺纤维化发生率明显高于其他原因引起的肺炎,其机理尚不清除,MMPs可能起关键作用[17-20]。因此研究有关MMPs的肺损伤和肺纤维化机制具有重要要义。细胞因子风暴包含了多种炎性细胞产生的多种炎性介质,在它们的共同作用下引起肺损伤和ARDS,网络型细胞因子调控损伤机理极为复杂,MMPS也受多重因素的调控,本研究只选择了IL-1β、TNF-α、IL-6、NE等几种最常见的炎性介质,也只选择了MMP2一种代表性MMPs,需要进一步扩大深入研究。