1例人感染牛源E型蓝氏贾第虫病的诊断

孙有朋，王 霞，符贻武，吴汉鹏，陈意纯，叶映蓉，杨正涛，周二顺

佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528225

蓝氏贾第虫（Giardia lamblia）又称蓝氏贾第鞭毛虫或十二指肠贾第虫，是鞭毛纲的人畜共患肠道内寄生原虫[1]。蓝氏贾第虫有滋养体（9～20 μm×5～12 μm，倒置梨形）和包囊（10～14 μm×7.5～9.0 μm，椭圆形）2 种形态。包囊为感染阶段的形态，其暴露于胃酸后脱囊形成滋养体并开始二分裂增殖。滋养体在暴露于胆汁或高pH 值的环境下形成包囊并排出体外从而感染新的宿主[2]。蓝氏贾第虫病主要通过粪口传播，也可通过直接接触传播，婴幼儿及免疫力低下者尤为易感，患者症状主要为腹泻、腹痛及生长发育不良[3-4]。蓝氏贾第虫感染导致的腹泻通常有恶臭气味且油腻（脂肪痢），该病原除与宿主争夺营养外，还会造成肠上皮细胞凋亡及免疫屏障的丧失[5]。

根据目前对蓝氏贾第虫基因型的研究，已证明蓝氏贾第虫可被分为A～H 8 种集聚体。集聚体A和集聚体B 为人感染的主要集聚体类型，同时也能感染犬、猫等伴侣动物，也有少量人感染其他聚集体类型的报道[6]；集聚体C 和集聚体D 主要感染猫科动物；集聚体E 主要感染牛、羊等偶蹄类动物[7-8]。蓝氏贾第虫在发展中国家的感染情况尤为严重，尤其是亚洲、非洲与拉丁美洲，据报道每年全球约超过2 亿人感染贾第虫病[9]。然而，大量的隐性感染和较高的误诊率带来的防控难度的提升使蓝氏贾第虫相关研究显得尤为必要[10]。在近几年动物感染蓝氏贾第虫的调查报道中，广东某地奶牛蓝氏贾第虫感染率最高可达74.2%[11-13]。同时，有报道提供了一些E 型集聚体感染人的案例[14]，这引发了我们对牛羊养殖业相关从业人员的担忧。在本研究中，采集了本实验室内常与牛羊接触的成员的粪便进行镜检，并对其DNA 样品进行巢式PCR 扩增，以评估相关人员蓝氏贾第虫的感染风险并为其预防、临床诊断及相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

收集本实验室20 位成员的中段晨粪存于50 mL无菌离心管中，分别标记好每个人的性别、是否腹泻等基本信息，样品短暂保存于4 ℃待测。

1.2 镜检

首先，用直接涂片镜检法检查肠道寄生虫多样性，于洁净的载玻片中央滴1 滴生理盐水，用牙签挑取火柴头大小的新鲜粪便置于生理盐水中并涂抹均匀，盖上盖玻片置于镜下观察，每个样品重复检查5 次。然后，用33%硫酸锌溶液漂浮法尝试富集蓝氏贾第虫卵，取1 g 粪便于15 mL 离心管，加入10 mL 生理盐水充分震荡混匀后离心10 min。弃上清，加入10 mL 硫酸锌溶液，震荡混匀后离心10 min，最后取上清镜检。

1.3 DNA 提取

1.4 蓝氏贾第虫BG、GDH、TPI 基因扩增

采用巢式PCR对目的基因进行扩增，所用引物序列参考Bartley等[15]的报道，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，具体见表1。PCR体系由4 μL dNTP（25 mmol/L）、5 μL 10×buffer、0.6 μL Taq Polymerase（2.5 U/μL）、2 μL BSA（10 mg/mL）、1 μL Forward primer（10 μmol/L）、1 μL Reverse primer（10 μmol/L）、2 μL DNA 以及34.4 μL 去离子水组成，共50 μL。Taq DNA 聚合酶（Perfect－StartTMTaq DNA Polymerase，AP401）购自北京全式金生物技术有限公司。用于PCR扩增的热循环仪（Mini Amp）由赛默飞世尔生产，第1 轮扩增BG及GDH基因退火温度为57 ℃，TPI基因退火温度为55 ℃;第2 轮扩增3 种基因退火温度均为60 ℃。DNA 扩增结束后取5 μL 产物加入1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，30 min 后把凝胶放入全自动凝胶成像仪（C280,Azure Biosystems）中进行拍摄。

表1 BG、GDH 及TPI 引物序列

1.5 基因序列分析

委托擎科生物科技有限公司对鉴定为阳性的DNA 扩增产物进行测序。将获得的序列经DNAstar拼接后，与从Genbank 数据库中下载的序列进行对比以确定其蓝氏贾第虫的基因型及亚型。从Genbank上选择不同类型的参考序列使用Mega11 软件进行进化树分析。采用邻接法（neighbor-joining method），自展值设置为1 000 次重复。

2 结果

2.1 镜检

样品经过涂片镜检未发现有寄生虫卵或虫体出现，经硫酸锌溶液漂浮后未见蓝氏贾第虫包囊。由于蓝氏贾第虫隐性感染比例较大，镜检灵敏度稍差，同时对样品基于BG、GDH、TPI位点进行了巢式PCR扩增，并进行琼脂糖电泳。

2.2 PCR 扩增结果

对20 份DNA 样品进行扩增后电泳结果显示其中有1 份样品的BG基因扩增结果为阳性，条带位置在500 bp 左右（图1），而GDH和TPI位点均未见目的条带。该患者为男性，无腹痛、腹泻等胃肠道症状。本次调查蓝氏贾第虫阳性率为5%（1/20）。

图1 粪样DNA 基于BG 位点巢式PCR 扩增产物电泳图

2.3 基因型分析

将阳性样品的第2 轮扩增产物送至擎科生物科技有限公司测序，序列经DNA Star 拼接后与Genbank数据库比对，鉴定为集聚体E 型，其亚型为E1。

2.4 进化发育分析

将拼接后的序列同参考序列构建系统发育进化树，结果如图2 所示。本次发现的E 型集聚体与A 型集聚体发育距离较近。

图2 蓝氏贾第虫系统发育进化树分析

3 讨论

以腹痛、腹泻为主要症状的蓝氏贾第虫病可能会导致生长发育期的儿童营养不良、消瘦甚至发生慢性胃肠疾病[16]。1 项美国门诊儿童腹泻病因的调查数据显示，当地非痢疾性腹泻的儿童贾第虫感染率达15%，同时大量的隐性感染者会将虫卵带给家庭成员[17]。蓝氏贾第虫可能会对肠道消化吸收功能造成持久的不良影响，一些研究表明蓝氏贾第虫的接触会使肠上皮的细胞骨架绒毛蛋白和紧密连接蛋白降解，蓝氏贾第虫引起的慢性胃肠疾病等后遗症可能与该上皮屏障的改变有关[18-20]。对贾第虫病的预防与治疗，目前尚未有获批上市的可用于人的疫苗、也没有特异性治疗药物，常用的治疗药物主要包括甲硝唑、替硝唑、呋喃唑酮等[21]。针对贾第虫病，预防是低成本的有效方法。鉴于其传播特点，保障水源清洁和做好个人卫生是预防该病的关键。

如今卫生条件的逐渐改善对人畜共患寄生虫病的防控有积极的意义，然而越来越多的集聚体E感染人的报道表明牛、羊等反刍动物携带的病原应得到重视[22-23]。随着分子生物学技术的发展，人们对贾第虫人畜共患的威胁有了更深刻的认识[24]。Chen等[25]在中国黑骨山羊中发现了检出率高于集聚体E的集聚体A，而且发现集聚体A 与集聚体E 的核苷酸相似度要高于其他集聚体类型。Fantinatti等[14]在巴西学龄前儿童中检测到的44 份贾第虫阳性样本中发现有15 份样本属集聚体E。Giangaspero等[26]在意大利中部绵羊中检测到的贾第虫类型全部为集聚体A。通过发育树的构建发现，本研究所得到的集聚体E 同样与参考序列中的集聚体A 具有较高的同源性，这很可能意味着人与牛、羊等偶蹄动物互相传播贾第虫病的潜力较大。

综上所述，本研究发现人感染E 型蓝氏贾第虫1 例，且该集聚体与A 型集聚体发育距离较近。因此，集聚体E 可能存在较大的人畜传播的风险。在以后的研究中将进一步分析牛羊养殖业工作人员贾第虫感染情况及集聚体的多样性，以评估其感染风险。