润肠通秘茶的超高效液相色谱指纹图谱研究及其6 种成分含量测定

马琳琳，周荻书，林瑞仪，吴明安，郑国扬，郑开荣，李伟荣，王奇，潘华峰 （. 广州中医药大学科技创新中心，广东 广州 50405；. 大兴安岭天草药业有限公司，黑龙江 大兴安岭 6599）

便秘是临床常见病、多发病，慢性便秘表现为排便次数减少、粪便干硬和（或）排便困难，病程至少为6 个月[1]。我国目前慢性便秘的发病率已高达3.19%～11.6%，尤以中老年人居多[2-3]。润肠通秘茶原名为饮益通袋泡茶，为黑龙江省中医研究院的院内制剂。处方源于《太平惠民和剂局方》的黄芪汤，由黄芪、陈皮、当归、肉苁蓉、火麻仁、蜂蜜组成，治疗气血两虚型便秘有显著疗效[4-6]。中老年人多肾阴不足、五脏虚损，尤以气血亏虚，生化乏源，肠燥津亏而致便秘多见[7]。润肠通秘茶在原方的基础上增加了当归、肉苁蓉，取其养血补肾润肠作用，共奏益气行气，养血润肠通便之功效。目前未见润肠通秘茶的质量分析研究。本实验采用超高效液相色谱（UPLC）法建立润肠通秘茶的指纹图谱，并用聚类分析（CA）及主成分分析（PCA）等进行化学模式识别，同时对润肠通秘茶所含6 种主要成分进行含量测定，以控制润肠通秘茶的质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters ACQUITY H-CLASS 超高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；MS204 型万分之一电子天平、TLE3002 型千分之一电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；PL-S80TX 超声波清洗机（东莞康士洁超声波科技有限公司），Eppendorf Centrifuge 5804 R 型离心机（德国艾本德公司）。

1.2 材料 橙皮苷（批号：wkq22010509）、芒柄花素（批号： wkq210615090）、 毛蕊花糖苷（批号：wkq22031108），四川省维克奇生物科技有限公司，含量均大于98%；阿魏酸（批号：G27A11L112005）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：Y16O11H127829）、松果菊苷（批号：Y12D8H50506），上海源叶生物科技有限公司，含量均大于98%；乙腈、甲醇为色谱纯；其余试剂为市售分析纯；水为娃哈哈纯净水；11 批润肠通秘茶由大兴安岭天草药业有限公司提供，批 号（编 号）：211101（S1）、211102（S2）、211001（S3）、211002（S4）、220102（S5）、220101（S6）、211201（S7）、211202（S8）、210902（S9）、210903（S10）、210801（S11）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 润肠通秘茶的制备 精密称定润肠通秘茶1 g，置于具塞锥形瓶中；精密加入70%稀甲醇30 mL，密塞，称定质量；超声处理60 min，取出，放冷，再称定质量；用70%稀甲醇补足减失的质量，摇匀。静置后将提取液转移至离心管中，于25 ℃，以11 000 r·min-1离心15 min（离心半径：10.8 cm）。取上清液，0.22 μm 滤膜滤过，即得。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取适量的松果菊苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素对照品，溶于二甲基亚砜，配制成浓度分别为1.09、1.08、1.22、1.20、1.17、0.49 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱为Ultimate UHPLC AQ-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；检测器为二极管阵列检测器；流速：0.5 mL·min-1；柱温：28 ℃；检测波长：280 nm；进样量：2 μL；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）。梯度洗脱，洗脱程序为：0～15 min，5%→40% A；15～18 min，40%→95% A；18～23 min，95%→95% A；23～25 min，95%→5%A；25～27 min，5% A。

2.3 润肠通秘茶UPLC 指纹图谱研究 按“2.1.1”项下方法制备11 批润肠通秘茶的供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，进样测定，记录色谱图。将11 批润肠通秘茶的色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 年版）进行分析。设置S2 批次为参照谱图，使用中位数进行自动匹配，时间窗宽度设置为0.1，通过多点校正法对色谱峰进行Mark 峰匹配，生成11 批润肠通秘茶的指纹图谱以及共有模式图谱，确定14 个共有峰。见图1。

图1 11 批润肠通秘茶供试品超高效液相指纹图谱（A）和共有模式图谱（B）Figure 1 UPLC fingerprint of 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples（A）and their common mode（B）

2.3.1 精密度试验 按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液（S6），连续进样6 次，以松果菊苷（分离度好、出峰时间及峰形稳定）为参照峰。记录润肠通秘茶样品14 个共有峰相对保留时间。结果显示，14 个共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.21%，相对峰面积的RSD 均小于7.93%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液（S6），平行6 份，进样，以松果菊苷为参照峰。记录14 个共有峰相对保留时间。结果显示，14 个共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.20%，相对峰面积的RSD 均小于7.45%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液（S6），室温下分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，以松果菊苷为参照峰S。记录14 个共有峰的相对保留时间。结果显示，14 个共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.20%，相对峰面积的RSD 均小于7.91%，表明24 h 内润肠通秘茶供试品溶液稳定性良好。

2.3.4 指纹图谱相似度及相对峰面积计算 使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 年版）计算11 批润肠通秘茶之间的相似度，相似度介于1～0.992。结果见表1。11 批润肠通秘茶中14 个共有峰相对峰面积的RSD 在2.60%～16.15%范围内，表明11 批润肠通秘茶之间的化学成分含量存在一定差异。结果见表2。

表1 11 批润肠通秘茶供试品指纹图谱的相似度结果Table 1 Similarities of 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

表2 11 批润肠通秘茶供试品共有峰的相对峰面积Table 2 The relative peak areas and RSDs of 14 common chromatographic peaks of 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

2.3.5 指纹图谱色谱峰指认 取供试品（S6）溶液和混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，获取对应色谱图。将两个色谱图进行比对，根据出峰时间，指认5 号峰为松果菊苷，6 号峰为阿魏酸，7 号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，8 号峰为毛蕊花糖苷，12 号峰为橙皮苷，14 号峰为芒柄花素。见图2。

图2 混合对照品（A）和润肠通秘茶供试品（B）的超高效液相色谱图Figure 2 Mixed reference（A）and UPLC fingerprint of Runchang Tongmi Tea samples（B）

2.3.6 聚类分析（CA） 将11 批润肠通秘茶的共有峰峰面积数据导入SPSS 25 软件，对峰面积进行Z-score 标准化法处理，运行系统聚类，通过欧氏距离对11 批样品进行聚类分析。结果见图3。当类间距离为10 时，可将11 批样品分为3 类：S9 自行聚为1 类；S11 自行聚为1 类；其余聚为1 类。

图3 11 批润肠通秘茶供试品聚类分析树状图Figure 3 Pheogram of hierarchical clustering analysis for 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

2.3.7 主成分分析（PCA） 将11 批润肠通秘茶共有峰峰面积的数据导入SPSS 25 数据分析软件，数据标准化处理之后，进行主成分分析。结果见表3 及图4。前3 个成分的累计方差贡献率大于85%，可以概括润肠通秘茶供试品数据的大部分信息；并且，在碎石图中特征值＞3 曲线陡峭，特征值＜3 后趋于平缓，表明提取3 个主成分合理。

表3 11 批润肠通秘茶供试品的特征值及累计方差贡献率Table 3 Characteristic values and cumulative variance contribution rates of 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

图4 11 批润肠通秘茶供试品的碎石图Figure 4 Scree plot for 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

通过SPSS 25 分析软件将11 批润肠通秘茶共有峰峰面积标准化处理后的数据作为变量，运用SIMCA 14.1 软件得到11 批润肠通秘茶的PCA 得分图。见图5。结果显示所有样品均在95%可信区间内，且分为3 类：S9 自行聚为1 类；S11 自行聚为1 类；其余聚为1 类，与CA 分析结果一致。

图5 11 批润肠通秘茶供试品主成分分析得分图Figure 5 Plot of PCA scores for 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

2.4 润肠通秘茶的含量测定

2.4.1 线性关系考察及检测限、定量限 精密量取“2.1.2”项下混合对照品溶液500 μL，加入等量甲醇，逐级稀释成10 个浓度。按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以浓度为横坐标（X），对应的色谱峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得各成分的线性回归方程。结果见表4。

表4 各成分的回归方程、线性范围和相关系数Table 4 The regression equation，linear range and correlation coefficient of each component

逐级稀释标准品溶液，按照信噪比（S/N= 3）计算松果菊苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素最低检测限，结果分别为：0.266、0.132、0.179、0.220、0.143、0.120 μg·mL-1。按照信噪比（S/N= 10）计算定量限，结果分别为：0.639、0.264、0.447、0.703、0.286、0.359 μg·mL-1。

2.4.2 精密度试验 精密量取适量混合对照品溶液，加入适量甲醇稀释，连续进样6 次，记录各成分峰面积。结果松果菊苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素峰面积的RSD分别为：0.35%、0.58%、0.41%、0.43%、0.39%、0.45%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液（S6），平行6 份，进样，记录各成分峰面积。结果松果菊苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素峰面积的RSD 分别为：3.81%、3.55%、5.62%、7.02%、6.95%、3.15%，表明供试品制备方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液（S6），分别于0，2，4，6，8，12，24 h 进样，记录各成分峰面积。结果松果菊苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素峰面积的RSD 分别为：0.36%、6.07%、7.65%、1.70%、0.39%、2.02%，表明24 h 内供试品溶液稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取润肠通秘茶供试品（S6）溶液9 份，分成3 组，每组3 份，按相当于供试品中成分含量80%、100%和120%加入各对照品。按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算平均加样回收率。结果松果菊苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素分别为：102.35%、105.03%、85.86%、96.70%、103.44%、97.37%；RSD 分别为：1.78%、5.89%、7.63%、5.61%、1.98%、6.78%。

2.4.6 样品含量测定 按“2.1.1”项下方法制备11 批润肠通秘茶供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定。计算11 批润肠通秘茶中松果菊苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素的含量。结果见表5。

表5 11 批润肠通秘茶供试品含量测定结果（mg·g-1，n=3）Table 5 Determination results of 6 constituents in 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples（mg·g-1，n=3）

3 讨论

比较了回流和超声两种方法提取，由于回流提取所需时间较长，故本研究选择超声提取[8]。分别使用水及甲醇作为提取溶剂，发现用甲醇提取时出峰较多，故确定以甲醇为提取溶剂。在参考已有研究[9-10]的基础上，考察提取时间（30、45、60 min）、甲醇浓度（50%、70%、90%）、料液比（1∶30、1∶40、1∶50）3 个因素，用正交试验进行评价，最终确定70%甲醇、料液比1∶30、超声60 min 时，样品的色谱图中色谱峰峰形、分离度、峰高最佳。

关于测定成分的选择，主要参考《中国药典》（2015 年版）对制剂中各中药含量测定的要求进行确定[11]。《中药药典》中黄芪项下要求检测的成分有黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷，但黄芪甲苷的检测波长与其他成分的波长相差大，故参考相关研究[12-13]将黄芪甲苷更换为芒柄花素。经预试验，最终确定以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、阿魏酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷6 种成分作为含量测定指标。

对指纹图谱进行相似度分析及模式识别，发现11 批润肠通秘茶色谱图相似度大于0.991，且大部分的相似度结果为1，表明不同批次润肠通秘茶所含成分相似度高，质量稳定。聚类分析和主成分分析结果显示，11 批润肠通秘茶主要成分可分为3 类，批间成分差异较小。

综上所述，本实验建立了润肠通秘茶UPLC 指纹图谱及6 种成分含量测定方法，对其质量进行了整体评价，本方法快速、简单、准确，对润肠通秘茶质量标准的提升具有重要意义。