黄精调控ATR/Chk1 通路干预自然衰老大鼠血管老化的作用研究

石永芳，冯静月，梁梅，肖珍，秦臻（贵州医科大学，贵州 贵阳 550025）

血管老化是指随着年龄增长而出现血管结构及功能的退行性变化，它所引起的心脑血管疾病是我国老年人群死亡的主要原因之一[1-3]。随着我国社会老龄化程度的加深，针对血管老化的干预已迫在眉睫。近年研究[4-6]表明，血管老化与氧化应激、端粒及端粒酶功能低下、内皮祖细胞减少、细胞衰老等多种因素有关。本课题组前期研究[7-9]表明，中药黄精可有效降低衰老大鼠的氧化应激水平，促进其内皮祖细胞的数量和功能，提高细胞端粒酶活性，这与抑制细胞衰老的关键环节——DNA 损伤检测点ATM 与Rad3 相关蛋白激酶（ATR）/细胞周期检测点激酶1（Chk1）通路的活化密切相关。由于黄精对血管老化的多种相关因素均有调节作用，故推测其可能具有干预血管老化的作用。因此，本研究拟观察黄精对自然衰老模型大鼠老化血管管壁结构及功能的影响，并基于ATR/Chk1 信号通路探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 2 月龄雄性SD 大鼠10 只，SPF 级，体质量（247±13）g；18 月龄雄性SD 大鼠40 只，SPF 级，体质量（583±17）g。上述动物均购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0014，动物质量合格证号：430726210100278028。本实验经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准，批文号：1800014。

1.2 药物及试剂 黄精，购自贵州威宁天露生物科技开发有限公司，批号：01137009，经贵州医科大学药学院龙庆德教授鉴定为正品。黄精水煎液制备：按每克生药加饮用水6 mL，浸泡30 min 后煮沸，文火慢煎40 min，趁热过滤；二煎按每克生药加水4 mL 煮沸后，煎法同前，合并2 次滤液；60 ℃下水浴浓缩至生药量为0.5 g·mL-1，置于4 ℃冰箱保存。多聚甲醛，北京雷根生物技术有限公司，批号：1014A21； 苏 木 精- 伊 红（HE）染 液（批 号：CR2103154）、Masson 染液（批号：CR2103039），均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：A015-3-1；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性检测试剂盒（批号：BC1195）、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒（批号：BC0025）、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（批号：P1200-2）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：PC0020）、高效RIPA 组织/细胞裂解液试剂盒（批号：R0010），均购自北京索莱宝科技有限公司；ATR 抗体（批号：13934）、Chk1 抗体（批号：2360）、p53 抗体（批号：32532）、β-actin（批号：4970）、辣根过氧化物标记羊抗兔二抗（批号：7074），均购自美国Cell Signaling Technology 公司；p21 抗体，英国Abcam 公司，批号：109199；GAPDH 抗体，武汉三鹰生物技术有限公司，批号：10494-1-AP；ECL 发光液，德国Millipore 公司，批号：WBKLS0100；封闭液（批号：P0023B）、一抗稀释液（批号： P0023A）、 二抗稀释液（批号：P0023D），均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 主要仪器 AB104-N 型精密分析天平、160323A型酶标仪，成都锦世昌祥科技公司；MY-20 型手持式电动匀浆机，上海净信实业发展有限公司；5810R型台式冷冻离心机，德国艾本德股份公司；TS100 型倒置显微镜，日本Nikon 公司；Mini-PROTEAN 电泳 系 统、Molecular Imager®Chemi DocTMXR System凝胶成像仪，美国Bio-Rad 公司；SLK-O3000-S 型LED 数显圆周摇床，美国赛洛捷克公司。

1.4 分组及给药 大鼠适应性喂养1 周后，将10 只2 月龄大鼠作为青年组，将40 只18 月龄的自然衰老大鼠按体质量随机分为老年组及黄精低、中、高剂量组（1、2、4 g·kg-1），每组10 只。黄精灌胃剂量按人与动物药物剂量标准换算，确定大鼠灌胃中剂量为2 g·kg-1，以中剂量的0.5、2 倍作为低、高剂量[7]。灌胃体积为10 mL·kg-1，每天给药1 次，持续给药12 周；青年组和老年组给予等量蒸馏水灌胃。末次灌胃后禁食12 h，颈椎脱臼处死大鼠，迅速打开腹腔；取出主动脉，生理盐水洗净，滤纸吸干；取主动脉弓部分血管浸于4%多聚甲醛溶液中固定，其余主动脉置于-80 ℃冰箱备用。

1.5 主动脉病理形态学观察 用4%多聚甲醛溶液固定主动脉30 min 后，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，制成5 μm 厚切片，行常规HE 染色和Masson 染色。在光学显微镜下观察各组大鼠主动脉组织病理形态学变化，并利用Image-Pro Plus 显微图像处理系统测量血管壁中膜平滑肌细胞（SMC）和胶原纤维（CF）的绝对面积，计算不同着色面积与测试区域整体面积之比，得出SMC 和CF 在中膜的相对含量（%）。

1.6 微量法检测主动脉中T-AOC、GSH-Px 活性及MDA 含量 称取约0.1 g 主动脉组织，加入1 mL 提取液进行冰浴匀浆，4 ℃下以8 000×g离心10 min 后取上清，BCA 法测定蛋白含量。然后按试剂盒说明书步骤操作，采用微量法分别检测T-AOC、GSH-Px活性和MDA 含量。

1.7 Western Blot 法检测主动脉中ATR、Chk1、p53及p21 蛋白表达水平 取各组大鼠主动脉组织约20 mg，加入含有PMSF 的RIPA 裂解液，匀浆后在4 ℃下以12 000 r·min-1（离心半径6 cm）离心15 min，取上清，采用BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度。加上样缓冲液及RIPA 裂解液调整蛋白浓度，上样量为40 μg 蛋白；经SDS-PAGE 电泳、转膜后，用封闭液封闭2 h；加入一抗ATR（1∶1 000）、Chk1（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、p21（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）后，于4 ℃下孵育过夜；加入二抗（1∶3 000）后在室温下孵育2 h；采用超敏ECL 显色液显影并扫描。以GAPDH 或β-actin 为内参，采用ImageJ 软件分析条带灰度值，并对目的蛋白进行半定量分析。

1.8 统计学处理方法 采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数± 标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄精对衰老大鼠主动脉结构的影响 结果见图1。与青年组比较，老年组大鼠的主动脉内膜出现损伤且不光滑，可见泡沫细胞浸润，中膜细胞排列紊乱，弹力膜扭曲、断裂、结构不完整且明显增厚。与老年组比较，黄精各剂量组大鼠的主动脉内膜较为连续平整，损伤程度较轻，弹力膜结构较完整，扭曲、断裂现象较少出现，中膜增厚不明显。结果表明，黄精能改善衰老大鼠主动脉的结构病理变化，起到延缓血管老化的作用。

图1 黄精对衰老大鼠主动脉结构的影响（HE 染色，×200）Figure 1 Effect of Polygonati Rhizoma on aortic structure of aging rats（HE staining，×200）

2.2 黄精对衰老大鼠主动脉SMC、CF 的影响 结果见图2、表1。与青年组比较，老年组大鼠主动脉胶原染色区域明显增多，SMC、CF 相对含量显著升高（P＜0.01）；与老年组比较，黄精各剂量组大鼠主动脉胶原染色区域减少，SMC、CF 相对含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，黄精可降低衰老大鼠主动脉的SMC 及CF 相对含量。

表1 黄精对衰老大鼠主动脉中平滑肌细胞（SMC）和胶原纤维（CF）的影响（±s，n=3）Table 1 Effects of Polygonati Rhizoma on smooth muscle cells（SMC）and collagenous fibers（CF）in aorta of aging rats（±s，n=3）

表1 黄精对衰老大鼠主动脉中平滑肌细胞（SMC）和胶原纤维（CF）的影响（±s，n=3）Table 1 Effects of Polygonati Rhizoma on smooth muscle cells（SMC）and collagenous fibers（CF）in aorta of aging rats（±s，n=3）

注：与青年组比较，**P＜0.01；与老年组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

CF 相对含量/%22.35±1.14 32.09±1.16**28.30±0.83##27.56±1.85##25.61±0.93##组别青年组老年组黄精低剂量组黄精中剂量组黄精高剂量组剂量/（g·kg-1）--124 SMC 相对含量/%25.22±0.75 33.67±0.72**31.68±0.67#30.91±1.68##28.91±0.84##

图2 黄精对衰老大鼠主动脉中平滑肌细胞和胶原纤维的影响（Masson 染色，×200）Figure 2 Effects of Polygonati Rhizoma on smooth muscle cells and coll agenous fibers in aorta of aging rats（Masson staining，×200）

2.3 黄精对衰老大鼠主动脉中T-AOC、GSH-Px活性及MDA 含量的影响 结果见图3。与青年组比较，老年组大鼠主动脉中T-AOC、GSH-Px 活性显著降低（P＜0.01）， MDA 含量显著升高（P＜0.01）；与老年组比较，黄精中、高剂量组大鼠主动脉中的T-AOC、GSH-Px 活性显著升高（P＜0.01），MDA 含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，黄精可能通过提高T-AOC、GSH-Px 活性，降低MDA 含量来缓解衰老大鼠主动脉的氧化应激状态。

图3 黄精对衰老大鼠主动脉中T-AOC、GSH-Px 活性及MDA 含量的影响（±s，n=3）Figure 3 Effects of Polygonati Rhizoma on T-AOC and GSH-PX activity and MDA content in aorta of aging rats（±s，n=3）

2.4 黄精对衰老大鼠主动脉中ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表达的影响 结果见图4。与青年组比较，老年组大鼠主动脉中ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表达显著上调（P＜0.01）；与老年组比较，黄精中、高剂量组大鼠主动脉中ATR、Chk1 蛋白表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01），黄精高剂量组大鼠主动脉中p53 蛋白表达显著降低（P＜0.01），黄精低、中、高剂量组大鼠主动脉中p21 蛋白表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，黄精可能通过调节ATR/Chk1 信号通路来延缓衰老大鼠的血管老化。

图4 黄精对衰老大鼠主动脉中ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 4 Effects of Polygonati Rhizoma on the protein expressions of ATR，Chk1，p53 and p21 in aorta of aging rats（±s，n=3）

3 讨论

血管老化引起的动脉供血功能降低会引发多器官的逐步衰退，提示血管老化可能是生物机体衰老的关键启动因素[10]，若能有效干预血管老化，对降低心脑血管疾病的发病率和死亡率具有重要意义。中药黄精具有抗衰老作用，《名医别录》记载了黄精能“补中益气，除风湿、安五脏，久服轻身延年不饥”。近年来关于黄精抗衰老的药理学研究主要集中在提高免疫功能[11]、保护心脏[12]、改善肾功能及认知功能障碍等方面[13-15]，关于黄精对血管老化干预方面的研究少有报道。因此，本研究分别从组织病理、氧化应激等多方面检测了主动脉中可直接或间接反映血管老化的指标，探讨了黄精干预自然衰老大鼠血管老化的可能机制。

随着年龄的增加，血管在形态和功能上会出现衰老变化，可见内皮细胞、平滑肌细胞（SMC）形态学异常，胶原增加，弹力纤维减少、断裂等[16]。其中，SMC 增殖导致的血管壁增厚是血管老化的特征之一，主要体现在内膜和中膜层厚度的变化[17-18]。本研究观察了自然衰老大鼠主动脉的病理形态学变化，HE 染色结果表明，老年组大鼠的主动脉出现内膜和中膜明显增厚，SMC 排列紊乱，弹力膜疏松、厚薄不均且断裂；经黄精干预后，大鼠主动脉内膜和中膜增厚不明显，SMC 排列整齐、规则，弹力膜疏松、厚薄不均、断裂现象较少出现。Masson 染色结果显示，老年组大鼠主动脉SMC 和胶原纤维（CF）相对含量明显增多，经黄精干预后SMC 和CF 相对含量明显减少。本实验结果从血管形态学方面证实了黄精能够改善衰老大鼠的血管老化。

氧化应激在血管老化过程中起着关键作用，T-AOC、GSH-Px、MDA 是氧化应激反应酶或产物的变化指标，可在一定水平上反映血管老化的程度[4，19]。抗氧化酶T-AOC 和GSH-Px 是机体清除细胞内活性氧的重要物质，是反映机体或者器官（组织）抗氧化能力的重要参数，也能反映机体内氧化应激水平的变化[20]。T-AOC 代表体内酶性和非酶性抗氧化物的能力，可综合反映机体内的抗氧化酶活力和抗氧化系统的功能状态；GSH-Px 可有效清除自由基诱发的脂质过氧化物，减轻细胞受损程度。MDA 是氧自由基引发细胞脂质过氧化的产物之一，其含量高低可间接反映细胞的损伤程度。本研究表明，老年组大鼠主动脉氧化应激水平明显增高，经黄精干预后，大鼠主动脉的T-AOC、GSH-Px 活性明显升高，MDA 含量明显降低。表明黄精能提高衰老大鼠主动脉的总抗氧化能力，并抑制氧自由基对衰老大鼠体内的脂质过氧化损伤程度，降低血管氧化应激状态，从而延缓血管老化的发生。

氧化应激是导致血管组织DNA 损伤的主要原因之一[21]。为了避免将损伤的基因组传递给子细胞，正常机体内具有一套高度保守的DNA 损伤修复机制。DNA 损伤会激活细胞周期DNA 损伤检测点，使细胞周期停滞，从而给予DNA 充足的时间进行修复，或在损伤不可修复的情况下使细胞死亡。从G1 期结束到S 期、G2 期，对细胞周期的控制主要由ATR/Chk1通路介导[22]。DNA 损伤发生后，ATR 聚集于损伤部位并被激活，其下游的Chk1 随之激活，而Chk1 能激活p53 及其下游基因p21，使细胞周期停滞，以利于DNA 损伤的修复。然而，当ATR 被过度激活或发生突变时，细胞周期检测点功能失调，进而影响到基因组的稳定性，使细胞周期过度阻滞，引起细胞增殖出现不可逆的停滞，最终导致细胞衰老[23]。本研究结果显示，老年组大鼠主动脉ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表达显著升高；经黄精干预后，大鼠主动脉ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表达均明显降低。结果表明，血管老化涉及到血管组织DNA 损伤检测点ATR/Chk1 通路的过度激活，而黄精可能通过抑制ATR/Chk1 通路的活化来延缓血管老化。

综上所述，黄精可延缓自然衰老大鼠的血管老化，可能与其增强血管抗氧化应激能力，抑制ATR/Chk1 通路的活化，从而减轻DNA 损伤应答有关。