基于UHPLC-QE-MS 及网络药理学探讨固本化湿降脂汤调控肥胖大鼠进食机制

易菲，李淑豪，易玉柳，周丽，苏丹，王万春，严张仁，邱明亮，曾晶晶，陈浩，（.江西中医药大学，江西 南昌 000；.南昌大学第二附属医院影像中心，江西 南昌 0006；.江西省中医药管理局中药药效（防治精神障碍脑疾病）评价重点研究室，江西 南昌 0006；.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 0006）

肥胖症是指有机体内脂肪含量过剩或局部脂肪含量增加及分布异常的慢性代谢性疾病[1]。近50 年中，全球患有肥胖症的人数越来越多，达到了大流行水平[2]。单纯性肥胖患者体质大多属于脾虚湿阻型[3]。大脑可调节机体的代谢功能，包括食物摄取、葡萄糖吸收等；肠道可以调控肝葡萄糖产生和胰岛素抵抗，与肥胖的发生密切相关；中枢神经和肠道相互作用的传导系统称为肠-脑轴，可通过多种生理活动参与动物进食机制和体质量调节[4]。

固本化湿降脂汤是本课题组临床经验方，由宋代《太平惠民和剂局方》中的参苓白术散化裁而成，具有益气健脾，祛湿化痰的功效。本课题组前期研究[5]发现本方在临床上能降低肥胖患者血脂水平，治疗肥胖颇有成效。但其如何调控脾虚湿阻型单纯性肥胖患者进食神经的作用机制尚不明确。

本实验采用UHPLC-QE-MS 技术对固本化湿降脂汤进行体内外成分分析，得出入血成分；应用网络药理学的方法对入血成分进行靶点预测，并分析其生物过程及信号通路；结合体内实验深入探究，对脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠的下丘脑、血清等多个指标进行检测分析，以期探索本方对肥胖大鼠进食神经紊乱的调控机制。本实验的研究流程见图1。

图1 固本化湿降脂汤调控肥胖大鼠进食机制实验研究流程图Figure 1 Flow chart of the experimental study of Guben Huashi Jiangzhi Decoction on feeding mechanism of obesity rats

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD 雄性大鼠60 只，6 周龄，SPF 级，体质量170～210 g，购于江西中医药大学动物科技中心，动物质量合格证号：0002119，动物生产许可证号：SCXK（赣）2018-0003。饲养于江西中医药大学基础医学实验中心动物房，动物使用许可证号：SYXK（赣）2022-0002。饲养环境的温度为20～24 ℃，相对湿度为45%～55%。本研究由江西中医药大学实验动物伦理委员会审批，动物福利伦理审查批准号：JZLLSC20220797。

1.2 药物及试剂 固本化湿降脂汤处方为：党参6 g、荷叶15 g、红曲9 g、茯苓12 g、炒薏苡仁9 g、北山楂12 g、炒白术9 g、炒山药9 g、枳实9 g、丹参12 g、决明子12 g、淡竹叶12 g、陈皮12 g、绿萝花2 g、砂仁6 g、盐泽泻9 g。处方中的决明子，康美药业股份有限公司，批号：210700189；红曲，浙江桐居堂中药饮片有限公司，批号：210429；其余中药材均来自江西江中中药饮片有限公司，批号分别是：210622、210630、210608、210708、210725、210804、210806、210305、210401、210622、210430、210704、210325、181230。备齐处方中所需的药材，委托江西中医药大学附属医院完成水煎剂制备。奥利司他，杭州中美华东制药有限公司，批号：H30019728；戊巴比妥钠，上海源叶生物科技公司，批号：L24A86142282；rabbit Anti-GAPDH 内参抗体，江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGAA002；Mouse Anti-POMC，武汉三鹰生物技术有限公司，批号：66358-1-IG；Rabbit Anti-AgRP，美国Lsbio 公司，批号：LSC292683。大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素18（IL-18）、大鼠脂肪素（Apelin）、大鼠脂联素（ADP）、大鼠瘦素（Leptin，LEP）、大鼠游离脂肪酸（FFA）ELISA 试剂盒，批号分别为：MM-0180R1、MM-0190R1、 MM-0047R1、 MM-0194R1、 MM-70340R1、MM-0553R1、MM-0096R1、MM-0324R1，均购自江苏酶免实业有限公司。

1.3 主要仪器 MD Spectramac M3 多功能酶标仪，美国MD 公司；Bio-rad Power Supplies Basic 电泳仪，美国Bio-rad 公司；SYNGENE G：BOXChemiXR5 凝胶成像系统，英国Syngene 公司；Thermo Sorvall ST 16R 高速冷冻离心机，美国Thermo 公司；Orbitrap Exploris 120 型高分辨质谱，美国Thermo Fisher Scientific 公司；Trans-Blot Turbo 170-4150 全能型蛋白转印系统，美国Bio-rad 公司；ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色谱柱，美国Waters 公司；Vanquish 型超高效液相，美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.4 固本化湿降脂汤入血成分分析

1.4.1 提取物样本的制备 委托江西中医药大学附属医院药学部制备固本化湿降脂汤，作为实验提取物；将提取物离心后，取上清300 μL 于EP 管中，加入1 000 μL 提取液（甲醇∶水=4∶1）；再超声，离心，过滤；每个样本各取200 μL，形成固本化湿降脂汤提取物样本。

1.4.2 血清样本的采集与制备 取6 只SD 雄性大鼠，随机分为空白血清组和含药血清组，每组3 只。实验前12 h，禁食不禁水。含药血清组大鼠灌胃生药量为34.4 g·kg-1的固本化湿降脂汤。空白血清组给予等体积的生理盐水。在给药2 h 后用2% 戊巴比妥钠40 mg·kg-1腹腔注射，深度麻醉大鼠，腹主动脉采集全血，静置，离心，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存，备用。

取400 μL 含药血清组血清样本，加入40 μL 盐酸；涡旋1 min，4 ℃静置15 min（重复4 次）；加入1.6 mL 乙腈，离心，取1 800 μL 上清液，氮吹干燥；加入150 μL 的80% 甲醇复溶，离心，取120 μL 上清液倒进样瓶中上机检测。空白血清组血清重复上述操作。

1.4.3 UHPLC-QE-MS 分析条件 色谱采用Waters UPLC BEHC18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）。流动相：0.1% 甲酸水（A）和0.1% 甲酸水乙腈（B）。线性洗脱梯度程序分别为：0～11 min，85%～25% A；11～12 min，25%～2% A；12～14 min，2%～2% A；14～14.1 min，2%～85% A；14.1～16 min，85%～85%A。利用质谱仪，选取飞行时间质谱的范围为100～1 500。使用Xcalibur 软件分析数据。

1.5 网络药理学分析

1.5.1 固本化湿降脂汤入血成分靶点与肥胖疾病相关靶点收集 通过Similarity ensemble approach（https://sea.bkslab.org/）数据库搜索固本化湿降脂汤入血成分的预测靶点。此外，在drugbank（https://go.drugbank.com/）、Genecards（https://www.genecards.org/）、Online Mendelian Inheritance in Man（https://omim. org/）、Therapeutic Target Database（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库中，以“obesity”为关键词查找单纯性肥胖的相关靶点。

1.5.2 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建 使用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index. html）在线制作韦恩（Venn）图，得到固本化湿降脂汤入血成分和肥胖疾病的共同潜在靶点，并通过String（https://www.stringdb.org/）数据库，构建PPI 网络。将上述结果导入cytoscope 3.5.1 软件进行可视化，使用centiscape插件，以度值（degree）、介数值（betweenness）和最短路径值（closeness）为指标，筛选出固本化湿降脂汤治疗肥胖的核心靶点。

1.5.3 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析 将共同潜在靶点导入 metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）数据库进行GO 功能分析及KEGG 通路富集分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

1.6 动物实验探究

1.6.1 动物分组、模型复制及给药 从54 只SD 大鼠中随机选取8 只SD 大鼠，定为正常组。剩余46 只SD 大鼠采用课题组前期脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠模型复制法[6]进行为期10 周的模型复制。模型复制结束后，选取40 只体质量≥500 g 的模型复制成功大鼠，随机分为阳性对照组、模型组及固本化湿降脂汤低、中、高剂量组，每组8 只，并继续给予高脂饲料喂养。固本化湿降脂汤的低、中、高剂量组分别灌胃给予8.6、17.2、34.4 g·kg-1的生药量；模型组和正常组分别灌胃等量生理盐水；阳性对照组灌胃0.037 5 g·kg-1的奥利司他胶囊水溶剂。每只大鼠灌胃2 mL，每日1 次，连续4 周。

1.6.3 ELISA 法检测大鼠血清IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、LEP、Apelin、ADP、FFA 的含量 药物干预4 周后取材。处理前禁食12 h，自由饮水，腹腔注射2 %戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）深度麻醉大鼠，腹主动脉采集血样，离心，获得上层血清，于-20 ℃保存，待测。严格按照试剂盒操作说明，采用ELISA技 术 检 测 血 清 中IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、LEP、Apelin、ADP 和FFA 表达。

1.6.4 Western Blot 法检测大鼠下丘脑POMC、AgRP蛋白的表达 采用“1.6.3”项下方法将大鼠深度麻醉，颈椎脱臼处死，手术钳打开大鼠脑子，剥离出下丘脑，-80 ℃保存。提取下丘脑总蛋白并测定蛋白浓度。严格按照试剂盒说明书操作，测定POMC、AgRP 这两个蛋白的表达。

1.6.5 统计学处理方法 以GraphPad Prism 8 软件作图。数据以均数± 标准差（±s）表示，采用SPSS 21.0 软件进行统计分析。采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）进行多组间比较，若方差不齐则采用Dunnett’s T3 法进行组间比较，若方差齐性则采用LSD-t法进行组间比较。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 固本化湿降脂汤入血成分分析 通过对固本化湿降脂汤提取物、含药血清以及空白对照血清进行比较，得到由正、负离子扫描下的中药提取物检测正负离子图、含药血清检测正负离子图，见图2。对大鼠血清中的药物成分进行筛选，鉴定出31 种入血成分，见表1，而这些成分可能是在体内发挥主要作用的潜在活性成分。

图2 UHPLC-QE-MS 对固本化湿降脂汤入血成分分析Figure 2 Analysis of components absorbed in the blood of Guben Huashi Jiangzhi Decoction by UHPLC-QE-MS

2.2 网络药理学分析

2.2.1 入血成分靶点、肥胖疾病靶点、PPI 网络的构建 通过相关数据库得到591 个固本化湿降脂汤入血成分靶点、2 712 个肥胖相关的靶点。将固本化湿降脂汤与疾病的靶标相互交叉，获得231 个共同潜在靶点，绘制韦恩图，见图3-A。将入血成分-靶点网络进行可视化处理，见图3-B。将共同潜在靶点，导入到STRING 数据库中得到一个有231 个节点数和2 130 条边的PPI 网络，再以Cytocape 3.5.1 收集，见图3-C。然后，筛选出度值、介数值和最短路径值的前3 个靶点，得到核心靶点IL6、EGFR、ESR1。

图3 固本化湿降脂汤调控肥胖大鼠进食机制的网络药理学分析图Figure 3 Network pharmacology chart of Guben Huashi Jiangzhi Decoction in regulating feeding mechanism of obesity rats

2.2.2 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析 GO 富集分析得到GO 条目2 165 个，其中生物过程（BP）条目1 828 个，包括对荷尔蒙的反应、细胞对含氮化合物的反应、对多肽激素的反应、对胰岛素的反应等；细胞成分（CC）条目158 个，包括膜筏、膜微域、突触后膜、树突、转录调节器复合体的整体成分等；分子功能（MF）条目179 个，包括转录因子结合、DNA 结合转录因子结合、铁离子结合、氧化还原酶活性、碳酸盐脱水酶活性等。选P值较大的前10 条通路进行可视化，见图3-D。

KEGG enrichment 分析结果表明共获得193 条显著富集的信号通路（P＜0.05）。在这些丰富的通路中，发现炎症反应在固本化湿降脂汤治疗过程中起着重要的作用。其中AGE-RAGE、HIF-1、乙型肝炎、细胞凋亡、癌症、麻疹等信号通路均参与抗炎作用。这表明固本化湿降脂汤通过一条或多条通路来发挥治疗肥胖的作用。选P值较大的前20 条通路可视化，见图3-E。

2.3 动物验证实验

2.3.1 大鼠体质量、Lee’s 指数结果 大鼠在肥胖模型复制阶段的精神状态有所欠缺，出现嗜睡，懒动，反应力慢等表征，给药一段时间后能明显看到大鼠的精神状态变好，活动量更高。如图4 所示，与正常组比较，模型组大鼠体质量和Lee’s 指数明显增加（P＜0.01，P＜0.05），表明模型组脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠模型复制成功；与模型组比较，阳性对照组及固本化湿降脂汤中剂量组体质量及Lee’s 指数都明显性降低（P＜0.05）。在固本化湿降脂汤给药的前3 周内，药物可抑制模型大鼠体质量的增加，从第4 周起体质量减轻得更为明显，表明本方对脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠有很好的减轻体质量的作用。

图4 各组大鼠体质量、Lee’s 指数图（±s，n=8）Figure 4 Charts of body mass and Lee’s index of rats（±s，n=8）

2.3.2 大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α 各指标的检测结果 如图5 所示，与正常组比较，模型组大鼠IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α 水平明显增加（P＜0.05，P＜0.001）；与模型组比较，阳性对照组及固本化湿降脂汤各剂量组IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α 水平都明显降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。结果表明，本方对脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠有抗炎效果。

图5 固本化湿降脂汤对脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠血清IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α 水平的影响（±s，n=8）Figure 5 Effects of Guben Huashi Jiangzhi Decoction on serum IL-6，IL-18，IL-1β，TNF-α in simple obesity rats with spleen deficiency and dampness obstruction syndrome（±s，n=8）

2.3.3 大鼠下丘脑中POMC、AgRP 蛋白表达结果 如图6 所示，与正常组比较，模型组大鼠POMC 蛋白表达水平明显降低（P＜0.001），AgRP 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性对照组及固本化湿降脂汤高、中、低剂量组POMC 蛋白表达水平均明显升高（P＜0.001），阳性对照组及固本化湿降脂汤中、高剂量组AgRP 蛋白表达水平都明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，固本化湿降脂汤各剂量对脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠下丘脑中POMC、AgRP 蛋白表达都有不同程度的影响，以高剂量及中剂量的表达效果更好。

图6 固本化湿降脂汤对脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠下丘脑中POMC、AgRP 蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 6 Effects of Guben Huashi Jiangzhi Decoction on the protein expressions of POMC and AgRP in hypothalamus of simple obesity rats of spleen deficiency and dampness obstruction syndrome（±s，n=3）

2.3.4 大鼠血清中LEP、Apelin、ADP、FFA 各指标的检测结果 结果见图7，与正常组比较，模型组血清中LEP、Apelin、FFA 含量明显升高（P＜0.05，P＜0.01），ADP 含量明显减低（P＜0.05）。与模型组比较，阳性对照组、固本化湿汤中剂量组血清LEP 含量明显降低（P＜0.001，P＜0.05）；阳性对照组及固本化湿汤高、中剂量组血清Apelin 含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；阳性对照组及固本化湿汤中、低剂量组血清FFA 含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；阳性对照组及固本化湿汤中剂量组血清ADP 含量明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，本方可有效调节脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠血清中LEP、Apelin、ADP、FFA 等各项指标水平。

3 讨论

中医注重脾胃相辅相成，肥胖患者多为人体气机、津液运化失常、胃强脾弱而致膏脂堆积，进而造成单纯性肥胖的发生。课题组前期研究[6]发现，固本化湿降脂汤可以调节脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠的代谢异常，但对其是否可以通过肠-脑轴来缓解肥胖的作用机制尚不明确。网络药理学旨在从整体上阐明药物的作用机制，应用整体思维于微观的生物层次，进而全面计算出中医药与生物分子的关联，从而能高效地预测中药的活性成分和分子机制。然而，网络药理学根据药物代谢参数标准，预测的化合物及靶点信息也会出现漏筛或者是假阳性结果[7]。为避免出现假阳性结果，本研究采用UHPLC-QEMS 进行系统的定性研究。

根据本研究的入血成分-靶点图、PPI 网络图可知，苯甲酸、烟酸、龙血素A 等是固本化湿降脂汤治疗单纯性肥胖的重要成分，核心靶点是IL6、EGFR、ESR1。已有研究[8]证实烟酸具有减肥的作用，适度地摄入烟酸，可降低血清中FFA 浓度，减少外周脂质积聚，从而改善肥胖大鼠脂质和葡萄糖代谢。IL-6 是一种多效性细胞因子，可增加全身胰岛素，减少脂肪肝变性和减少肝葡萄糖产生，纠正食物摄入的异常调节[9]。Mondanelli 等[10]证明，IL-6 受体阻断可能是肥胖治疗的有效选择。本文KEGG 富集分析结果显示，固本化湿降脂汤治疗肥胖的主要通路有HIF-1 信号通路、AGE-RAGE 信号通路等。AGE-RAGE 信号通路下调，可以抑制肥胖诱导的细胞活化和炎症反应[11-12]；抑制HIF-1 信号通路则会影响葡萄糖稳态、细胞应激、炎症和凋亡等重要调节因子的转录，减少脂肪组织诱导慢性炎症的发生[13-14]。炎症在肥胖的发病机制中至关重要，肥胖会导致脂肪组织产生炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18）[15]；其中IL-18 是由Nlrp1b1 炎症小体介导的，对能量过剩反应具有保护功能，可防止血脂异常和2型糖尿病的发展，并且高脂饮食诱导的肥胖会促进IL-18 水平上调[16]。本实验研究证明固本化湿降脂汤可降低炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18）的表达，参与炎症反应发挥对肥胖大鼠的治疗作用。此结果与网络药理学研究所预测的靶点IL-6 及炎症相关通路相吻合。

此外，炎症信号可以通过肠-脑轴来感知分子与细胞的作用机制[17]。而肠-脑轴主要依赖迷走神经的传入和传出等通路，进而促进脑轴生物标志物与肠轴生物标志物的相互调节，形成完整的负反馈回路，从而调节哺乳动物的食欲。中枢神经系统中的下丘脑是调节食欲的中枢，可分泌影响能量平衡的神经元——促食欲神经元AgRP 和抑食欲神经元POMC。Apelin、LEP 是具有降糖作用的肠道激素，不仅如此，LEP 还可以通过控制脂肪分解和脂肪生成来调节脂肪储存[18]；Apelin 能改善正常和肥胖小鼠肌肉的胰岛素敏感性，以刺激葡萄糖的吸收[19]。而ADP 可通过调控小胶质细胞活性抑制FFA 引发的下丘脑炎症，维持机体能量稳态[20]。FFA 作为脂毒性的重要标志，在所有主要的胰岛素靶器官中会引起胰岛素抵抗[21]。本研究显示，固本化湿降脂汤各剂量组均能不同程度地促进POMC 蛋白的表达，同时还可抑制AgRP 蛋白的表达。多项研究[22-23]表明，高脂饮食会导致Apelin 增肥反应和LEP 抵抗作用，导致LEP、Apelin 实际水平增高，与本研究结果一致，模型组LEP、Apelin 的水平升高；给药后LEP、Apelin 的水平出现不同程度的降低，ADP 激素水平增加，以此维持能量稳态，进而降低了FFA 水平，抑制了下丘脑炎症和胰岛素抵抗，改善了代谢，详见图8。

图8 下丘脑神经元和肠道激素相互作用图Figure 8 Interactions diagram of hypothalamic neurons and gastrointestinal hormone

综上所述，本研究应用网络药理学对固本化湿降脂汤入血成分进行分析，构建了PPI 网络图，揭示出固本化湿降脂汤的核心靶点、信号通路大部分都与炎症相关。通过进一步的实验验证发现固本化湿降脂汤可降低炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18）的水平，影响下丘脑中POMC、AgRP 蛋白的表达及血清中LEP、Apelin 等多项指标水平。综上，固本化湿降脂汤可能是通过降低炎症反应，调控肠-脑轴来抑制食欲，达到治疗脾虚湿阻型单纯性肥胖的作用。