芪仙汤对苯并芘加剧哮喘小鼠气道炎症及黏液高分泌的影响及机制研究

孙亦鹏，倪振华，刘金金，王雄彪（上海中医药大学附属普陀医院，上海 200062）

支气管哮喘是常见的慢性呼吸系统疾病，患病人数呈逐年上升趋势[1]。大气污染是哮喘发病的独立危险因素[2]，其不仅可诱发和加重哮喘的症状、降低肺功能、提高住院率[3]，还可导致哮喘患者出现激素抵抗[4]。苯并芘（BaP）是大气污染物中常见的、毒性最大的物质之一[5]。BaP 暴露可显著增加儿童的哮喘患病风险[6]，还可诱导哮喘模型肺组织中白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素13（IL-13）的分泌，加剧气道高反应性[7-10]。本课题组前期研究[11]也发现，BaP 可诱导气道上皮细胞黏液分泌增加。因此，以BaP 为代表的大气污染物可通过诱导炎症浸润和黏液分泌加剧哮喘肺损伤。而目前尚缺乏针对大气污染诱发和加重哮喘的有效治疗方案。芪仙汤是本课题组王雄彪教授根据多年临床经验总结的自拟方，临床试验和基础实验均显示其具有良好的抗哮喘作用[12-15]。体外实验[16]发现，芪仙汤提取物可下调BaP 诱导的气道黏蛋白5AC（MUC5AC）高表达。然而在动物体内，芪仙汤能否改善BaP 诱导的哮喘气道炎症浸润和黏液分泌尚不清楚。因此，本研究拟以卵蛋白（OVA）致敏法复制哮喘小鼠模型，以BaP 暴露法模拟大气污染，观察芪仙汤对BaP 加剧哮喘小鼠气道炎症和黏液分泌的影响，以及对活性氧（ROS）和磷酸化ERK（p-ERK）蛋白的作用，以期阐释其抗肺损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 动物4 周龄雌性BALB/c 小鼠40 只，SPF 级，体质量（20±2）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0002。动物饲养于上海中医药大学附属普陀医院动物房，动物使用许可证号：SYXK（沪）2018-0032。本实验经上海中医药大学附属普陀医院实验动物伦理委员会审批，批文号：DWEC-A-201804001。

1.2 药物及制备芪仙汤由黄芪30 g、仙灵脾30 g、巴戟天30 g、虎杖30 g、川芎15 g、旋覆花9 g、枇杷叶30 g、生地黄30 g 组成，购于上海中医药大学附属普陀医院，所有药材经上海中医药大学附属普陀医院药学部袁易主任药师鉴定均为正品。芪仙汤按常规方法煎煮，水煎液过滤、浓缩至含生药1.5 g·mL-1，置于4 ℃保存备用。

1.3 试剂OVA（批号：9006-59-1）、硫酸铝钾（批号：7784-24-9）、BaP（批号：B1760），均购自美国Sigma 公司；HE 染色试剂盒，上海碧云天生物技术公司，批号：C0105S；RNA 提取试剂盒，美国Zymo Research 公司，批号：R2052；TRIzol 试剂盒（批号：9109）、PrimeScript 逆转录试剂盒（批号：RR047）、TB Green PCR 反应液（批号：RR420），均购自日本Takara 公司；AB-PAS 染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司，批号：G1285；MUC5AC 抗体，美国Abcam 公司，批号：ab79082；p-ERK 抗体，美国CST 公司，批号：4370；兔IgG 免疫组化试剂盒，武汉博士德公司；ROS 检测试剂盒，南京建成生物工程公司，批号：E004-1-1。致敏液：将10%硫酸铝钾溶液与500 μg·mL-1的OVA 溶液等比例混匀，用氢氧化钠溶液将pH 值调至6.5，室温下静置1 h，离心、弃上清，在余下沉淀中加入生理盐水至初始体积即得；激发液：2 mg·mL-1的OVA 溶液。

1.4 主要仪器EG1150 型石蜡组织包埋机、RM2335型病理切片机、ST5010 型病理染色机、CV5030 型全自动玻璃盖片机，德国Leica 公司；BX43 型显微镜，日本Olympus 公司；T100 型梯度PCR 仪器，美国伯乐公司；ViiA7 型Real-time PCR 扩增仪，美国Applied Biosystems 公司；Countess 3 型全自动细胞计数仪、Varioskan LUX 型多功能酶标仪，美国Thermo公司。

1.5 模型复制、分组、给药及样本采集小鼠适应性喂养1 周后，将其随机分为：空白组、哮喘组（OVA）、BaP 组（OVA+BaP）和芪仙汤组（OVA+BaP+芪仙汤37.5 g·kg-1），每组10 只。OVA 致敏小鼠于第1 天和第15 天腹腔注射致敏液200 μL，并于第15、26、27、28 天麻醉后滴鼻激发液50 μL，空白组用生理盐水作为对照[17]。BaP 暴露小鼠于第16 天开始滴鼻BaP 溶液30 μL（320 μmol·L-1），每2 日1 次，共7 次[18]。按照人和动物体表面积折算的等效剂量确定小鼠每日芪仙汤的给药剂量为37.5 g·kg-1；芪仙汤组小鼠于第16 天开始灌胃给药，每日1 次，连续13 d，灌胃前将药液加热至37 ℃；其他各组用生理盐水灌胃。于第28 天取材，眼球失血法处死小鼠，剪去双侧肺外缘肺泡组织约2 mm，将左肺用福尔马林固定以行病理染色；右肺尖叶和心叶用于ROS 检测，右肺膈叶和中间叶用于RNA 提取。空白组、哮喘组、BaP 组和芪仙汤组未完成全程实验的小鼠数量分别为1、2、4、2 只。

1.6 HE 染色法检测肺组织病理形态学变化左肺标本经固定后，组织脱水，然后进行石蜡包埋、切片、烤片，苏木精-伊红染色，中性树胶封片后于显微镜下观察，并对肺组织炎症浸润程度进行评分[19]。

1.7 AB-PAS 染色法检测肺组织黏液分泌小鼠左肺切片脱蜡至水，蒸馏水洗2 min；阿利新蓝染色20 min，蒸馏水洗3 次，每次2 min；滴加氧化剂5 min，蒸馏水浸洗2 次；Schiff Reagent 浸染20 min，自来水流水冲洗10 min；苏木素染核5 min，水洗；酸性分化液分化2 s，水洗；Scott 蓝化液返蓝，水洗3 min；室温下晾干，二甲苯透明，封片；镜下观察、拍照，采用Image Pro Plus 软件测量黏液阳性区域面积并进行统计分析。

1.8 免疫组化法检测肺组织MUC5AC、p-ERK 蛋白表达小鼠左肺切片经过烤片、脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液煮沸进行抗原修复10 min，用PBS 冲洗3 次。5% BSA 封闭30 min，滴加一抗，置于4 ℃冰箱内，过夜。第2 天，PBS 冲洗3 次，滴加兔IgG 二抗，37 ℃下孵育60 min，PBS 冲洗3 次；滴加SABC 50 μL，37 ℃下孵育20 min，PBS 冲洗3 次；DAB染色，苏木素染核；镜下观察、拍照，采用Image Pro Plus 软件计算积分光密度（IOD）值，并测量面积（Area），以IOD/Area 值表示目的蛋白的相对表达量。

1.9 qRT-PCR 法检测肺组织IL-4、IL-13 mRNA表达取适量小鼠右肺组织，按RNA 提取试剂盒说明书步骤提取总RNA，检测RNA 浓度、纯度。采用Takara 逆转录试剂盒进行逆转录反应，反应条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保持。然后进行PCR 反应，反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃、5 s，95 ℃、30 s，60 ℃、34 s，共40 个循环。分析扩增曲线，计算Ct 值；以β-actin 为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算各组间目的基因的表达水平差异。引物合成由生工生物工程（上海）公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列Tabel 1 Primer sequences for PCR

1.10 DCFH-DA 探针法检测肺组织ROS 水平将新鲜右肺组织剪成1 mm3大小的组织块，在37 ℃下酶解25 min 后，用尼龙网收集单细胞悬浮液；将细胞重悬于含有DCFH-DA（10 μmol·L-1）的PBS 中，37 ℃下孵育30 min；然后用酶标仪在激发波长500 nm、发射波长525 nm 下检测，所得光密度（OD）值即作为荧光强度。

1.11 统计学处理方法采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芪仙汤对BaP 暴露哮喘模型小鼠肺组织炎症的影响结果见图1。HE 染色结果显示，与空白组比较，哮喘组小鼠的气道、血管周围炎症细胞明显增多，气道黏膜出现中断、不连续，炎症评分显著升高（P＜0.01）；与哮喘组比较，BaP 组小鼠的炎症细胞浸润进一步加剧，肺泡间隔断裂明显，炎症评分显著升高（P＜0.01）；与BaP 组比较，芪仙汤组小鼠的炎症细胞浸润、气道黏膜连续性均明显改善，炎症评分显著降低（P＜0.01）。结果表明，芪仙汤能够减轻BaP 暴露哮喘模型小鼠的肺组织炎症。

图1 各组小鼠肺组织HE 染色结果（HE 染色，×200；±s，n=6～9）Figure 1 Results of HE staining in lung tissue of mice in different groups（HE staining，×200；±s，n=6-9）

2.2 芪仙汤对BaP 暴露哮喘模型小鼠肺组织IL-4、IL-13 mRNA 表达的影响结果见图2。与空白组比较，哮喘组小鼠肺组织IL-4、IL-13 mRNA 表达明显上调（P＜0.05）；与哮喘组比较，BaP 组小鼠肺组织IL-4、IL-13 mRNA 表达显著上调（P＜0.01）；与BaP 组比较，芪仙汤组小鼠肺组织IL-4、IL-13 mRNA 表达显著下调（P＜0.01）。结果表明，芪仙汤对BaP 暴露哮喘模型小鼠肺组织Th2 型细胞因子表达具有抑制作用。

图2 各组小鼠肺组织的IL-4、IL-13 mRNA 表达（±s，n=6～9）Figure 2 The mRNA expressions of IL-4 and IL-13 in lung tissue of mice in different groups（±s，n=6-9）

2.3 芪仙汤对BaP 暴露哮喘模型小鼠气道黏液分泌的影响结果见图3。与空白组比较，哮喘组小鼠的气道黏液分泌显著增多（P＜0.01）；与哮喘组比较，BaP 组小鼠的气道黏液显著增多（P＜0.01）；与BaP组比较，芪仙汤组小鼠的气道黏液分泌显著减少（P＜0.01）。结果表明，芪仙汤对BaP 暴露哮喘模型小鼠气道黏液分泌具有抑制作用。

图3 各组小鼠肺组织黏液分泌染色情况（AB-PAS 染色，×200；±s，n=6～9）Figure 3 The mucus secretion in lung tissue of mice in different groups（AB-PAS staining，×200；±s，n=6-9）

2.4 芪仙汤对BaP 暴露哮喘模型小鼠气道MUC5AC蛋白表达的影响结果见图4。与空白组比较，哮喘组小鼠气道MUC5AC 蛋白表达显著上调（P＜0.01）；与哮喘组比较，BaP 组小鼠气道MUC5AC 蛋白表达显著上调（P＜0.01）；与BaP 组比较，芪仙汤组小鼠气道MUC5AC 蛋白表达显著下调（P＜0.01）。结果表明，芪仙汤对BaP 暴露哮喘模型小鼠气道黏蛋白表达具有抑制作用。

图4 各组小鼠肺组织MUC5AC 蛋白表达情况（免疫组化，×400；±s，n=6～9）Figure 4 The protein expression of MUC5AC in lung tissue of mice in different groups（IHC，×400；±s，n=6-9）

2.5 芪仙汤对BaP 暴露哮喘模型小鼠肺组织ROS 的影响结果见图5。与空白组比较，哮喘组小鼠肺组织ROS 水平明显升高（P＜0.05）；与哮喘组比较，BaP 组小鼠肺组织ROS 水平显著升高（P＜0.01）；与BaP 组比较，芪仙汤组小鼠肺组织ROS 水平显著降低（P＜0.01）。结果表明，芪仙汤改善BaP 暴露引起的哮喘模型小鼠肺损伤的作用可能与其降低ROS 水平有关。

图5 各组小鼠肺组织的ROS 水平（±s，n=6～9）Figure 5 Detection of ROS content in lung tissue of mice in different groups（±s，n=6-9）

2.6 芪仙汤对BaP 暴露哮喘模型小鼠气道p-ERK 表达的影响结果见图6。与空白组比较，哮喘组小鼠气道p-ERK 蛋白表达显著上调（P＜0.01）；与哮喘组比较，BaP 组小鼠气道p-ERK 蛋白表达明显上调（P＜0.05）；与BaP 组比较，芪仙汤组小鼠气道p-ERK 蛋白表达明显下调（P＜0.05）。结果表明，芪仙汤改善BaP 暴露引起的哮喘模型小鼠肺损伤的作用可能与其抑制ERK 通路有关。

图6 各组小鼠肺组织p-ERK 蛋白表达（免疫组化，×400；±s，n=6～9）Figure 6 The protein expression of p-ERK in lung tissue of mice in different groups（IHC，×400；±s，n=6-9）

3 讨论

中医医家认为大气污染病邪性质当属污秽之气、阴邪、雾露兼夹污浊[20]。苍天之气，清净则志意治，外邪犯肺，肺气消散不及，邪毒壅塞于肺，阻滞气机，发为哮病[21]，故污秽之气与哮病密切相关。且肺朝百脉，污秽之气久侵肺脏，日久而致肺气不足，无力行血，则血液瘀滞，肺气不得肃降发为哮病；外邪不能独伤人，必因正气不足，无力抵御污秽之气。肺主呼气，肾主纳气，肾虚无以纳气则喘；脾胃虚弱，土不生金，则肺失所养，脾肾虚弱可导致哮病[22]。因此，可将“污秽之气”归结为诱发哮病的外因，而“脾肾阳虚”则归结为内因。故中医治疗大气污染诱发的哮喘应以“补益脾肾、化瘀祛邪”之法。芪仙汤是由“二仙汤”化裁而来的临床经验方，具有补益脾肾，活血化瘀之功效，对治疗大气污染相关哮喘具有理论依据。

气道炎症是哮喘发病的关键机制之一，BaP 能通过多种诱导炎症机制加剧哮喘的肺损伤。研究发现，BaP 可诱导OVA 小鼠血液中产生更多的IgE 及嗜酸性粒细胞，并在肺部组织中分泌多种炎症细胞因子[8-10]；可增强骨髓中树突状细胞抗原提呈能力[7]；可诱导CD8+T 细胞、单核/巨噬细胞和NK-T 细胞在肺组织中浸润[18]，从而加剧哮喘的炎症反应。本研究发现，芪仙汤可抑制BaP 加剧的哮喘小鼠肺部炎症，抑制Th2 型细胞因子的分泌。

黏液高分泌是支气管哮喘的重要病理学改变，是哮喘病情恶化的重要原因[23]。黏蛋白是黏液的主要组成部分，其中MUC5AC 与哮喘关系最密切，基因敲除MUC5AC 不仅可抑制哮喘气道炎症，还可缓解哮喘的气道高反应[24]。本课题组前期研究发现，BaP 可诱导气道上皮细胞MUC5AC 表达量增加[11]，而芪仙汤提取物可抑制BaP 诱导的MUC5AC 表达上调[16]。本研究发现，芪仙汤对BaP 诱导的哮喘小鼠气道黏液分泌具有显著改善作用，并能抑制小鼠气道黏蛋白表达。研究[25-26]发现，中药地黄中的梓醇和虎杖中的白藜芦醇均可抑制哮喘小鼠黏液分泌，抑制MUC5AC 表达，芪仙汤的药理作用可能与此有关。

氧化应激在哮喘的发病机制中具有重要作用，也是大气污染加剧哮喘的原因之一。大气污染物可抑制哮喘小鼠肺组织中超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶的活性，从而提高ROS 水平[27]。本课题组前期研究[11]发现，在BaP 诱导肺上皮细胞MUC5AC 高表达的机制中与线粒体ROS 有关，而白藜芦醇可抑制线粒体ROS 的产生。此外，多种中药单体均具有抗氧化作用，如川芎嗪可通过提高SOD 水平抑制ROS 的产生[28]；黄芪甲苷Ⅳ可通过抑制线粒体钙超载降低线粒体ROS 水平[29]；淫羊藿苷可抑制细胞ROS 的产生，从而缓解顺铂的细胞毒性[30]。本研究结果表明，芪仙汤可抑制BaP 暴露哮喘模型小鼠肺组织中ROS产生，可能与芪仙汤含有上述抗氧化活性成分有关。

ERK 是信号通路中的重要激酶，可调节人体内细胞增殖、分化、凋亡和应激反应等生理病理过程。ERK 通路的过度激活可导致癌症、炎症等多种疾病[31]。研究[32]发现，ERK 通路在哮喘模型小鼠肺组织内异常激活，抑制ERK 通路可显著减弱其肺组织嗜酸性粒细胞浸润、黏液产生、炎症因子释放、气道平滑肌收缩和气道高反应性。本研究也发现，芪仙汤改善BaP 暴露引起的哮喘模型小鼠肺损伤的作用可能与其抑制ERK 通路有关。

综上所述，芪仙汤能够改善大气污染物BaP 加剧的哮喘肺部炎症、黏液分泌，具有较好的抗肺损伤作用，其机制可能与抑制ROS 及ERK 通路有关。