搜风愈喘方基于ERK/p38MAPK信号通路对支气管哮喘模型大鼠气道炎症的作用机制探讨

李牧瑶，陈晨，郭旭冉，张宇婧，梁磊，闫永彬，2，郑海涛，2（.河南中医药大学儿科医学院，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000）

支气管哮喘（bronchial asthma，简称哮喘）是由多种细胞与细胞组分参与的以慢性气道炎症为特征的异质性疾病，临床主要表现为反复发作的喘息、呼吸困难、胸闷、气促、咳嗽等[1]。本病的发生与遗传、变应原、空气污染、呼吸道感染等多种因素有关，调查[2]显示，哮喘的平均患病率呈逐年上升趋势，尤以儿童发病率最高，已成为儿童最常见的慢性呼吸道疾病[3]。本病若未能及时治疗，症状可随疾病进展而加重，严重影响患儿生长发育及学习生活，且造成严重的医疗卫生负担。目前，在国内外哮喘最新指南中，糖皮质激素被认为是治疗哮喘的一线用药，虽然能够缓解哮喘症状，但不良反应较多，对于生长发育期的患儿，长期大剂量使用糖皮质激素可影响哮喘患儿的钙磷平衡、骨胶原代谢，从而影响其生长发育[4]。

中医药对哮喘的研究历史悠久，并形成了较为完善的理论体系。河南中医药大学儿科医学院闫永彬教授长期从事于儿童呼吸及感染性疾病方向的研究，基于“久病入络”“暗瘀”学说提出“伏风暗瘀宿痰”的哮喘中医病机新说[5]，认为伏风为哮喘发作之诱因，暗瘀为其缠绵之祸首，宿痰为复发之根源，三者合之，致使气道痉挛而发病，且迁延难愈，并基于此创立祛风、化痰、活血法三法并行的搜风愈喘方，且在临床取得较好的疗效[6]。课题组前期初步证实了搜风愈喘方可通过调控白细胞介素（IL）-13、IL-25、转化生长因子β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）抑制哮喘气道重塑的作用[7]；并通过拆方理论证实搜风愈喘方拆方“祛宿痰方”可通过抑制NF-κB、PI3K-AKT、IL-17 信号通路的激活，从抑制炎症反应、调控细胞外基质等途径作用于哮喘[8]。

细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）和p38 丝裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）是MAPKs 信号通路调节炎症反应的重要通路，可通过激活和释放促炎细胞因子引起炎症反应[9-10]。气道炎症反应与杯状细胞化生、黏液分泌增多有关，IL-13能够与人支气管上皮直接相互作用，诱导杯状细胞增生，促进黏液分泌，其过程涉及ERK、p38MAPK和PI3K 信号传导途径[11]，而Th2 细胞因子的明显下降或气道上皮组织中p38MAPK 的表达下调可抑制黏液的分泌和炎症的浸润[12]。研究[13]发现p38MAPK 在过敏性气道疾病中作用于NF-κB 信号通路的上游，可调节IL-4、IL-13、TNF-α 等多种炎性因子。

本研究拟在前期研究[7-8]基础上，通过建立哮喘大鼠模型，基于ERK/p38MAPK 信号通路，从炎症角度以及气道组织结构变化入手，进一步探讨搜风愈喘方对支气管哮喘的作用机制，为中医药精准施治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD 大鼠，雄性，SPF 级，体质量为（150±20）g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008，动物质量合格证号：110322211102551612，于河南中医药大学动物实验室SPF 屏障环境内饲养，自由饮水摄食。本研究经河南中医药大学伦理委员会批准，批准号：DWLL2021011006。

1.2 药物及试剂搜风愈喘方（白僵蚕、蝉蜕、地龙、橘络、红花、党参、山楂、莱菔子、炙麻黄、杏仁、炙枇把叶、礞石、甘草），中药饮片均购于河南中医药大学第一附属医院门诊中药房，经河南中医药大学中药资源与鉴定学科代丽萍副教授鉴定合格；卵清白蛋白（OVA），美国Sigma 公司，批号：A5503；氢氧化铝佐剂，美国赛默飞公司，批号：WG325422；醋酸地塞米松片，上海克林制药股份有限公司，规格：每片0.75 mg，批号：2010072；盐酸氯胺硐注射液，福建古田药业有限公司，批号：H 35020148；4%多聚甲醛，北京兰杰柯公司，批号：BL539A；大鼠IL-13、TNF-α 酶联免疫吸附实验试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技公司，批号：G2DNUCZNPF，EELR2856c；p-p38 抗体，美国CST公司，货号：2859；ERK、p-ERK 抗体，武汉三鹰生物技术公司，货号分别为：1157-1-AP、28733-1-AP；p38MAPK，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：ab32142；总RNA 提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司，批号：20210513。

1.3 仪器NE-C28P 压缩雾化器，欧姆龙中国有限公司；GNP-9080BS-Ⅲ电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械；HBS-4009 全自动洗板机，南京德铁实验设备有限公司；RT-6100 酶标仪，美国Rayto 公司；TL-988 荧光定量PCR 仪，西安天隆科技有限公司；D3024R 台式高速冷冻离心机，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；SVE-2 垂直电泳仪，武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.4 药物制备搜风愈喘方用纯净水浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min，倒出药液、过滤；残渣复煎1 次，倒出药液。将2 次水煎液混合，置70 ℃恒温水浴，浓缩药液至0.63 g·mL-1，4 ℃保存备用。

1.5 分组及模型复制将32 只大鼠适应性饲养1 周后随机分为4 组，分别为正常对照组、模型对照组、地塞米松组、搜风愈喘方组，每组8 只。除正常对照组外，其余各组均建立哮喘大鼠模型[14]，具体如下：实验第l 天及第7 天，10% OVA 及氢氧化铝佐剂复合液1 mL，五点注射致敏；实验第14 至第28 天，给予1% OVA 雾化吸入25 min 激发哮喘。观察并记录大鼠情况。造模完成后各组随机挑选1 只大鼠进行模型评价，以大鼠出现点头呼吸、喘促、口鼻发绀、烦躁不安、频繁洗面、喷嚏、精神萎靡等症状为造模成功。

1.6 给药方法造模成功后，继续每日给予1% OVA雾化吸入25 min 激发哮喘，每次雾化吸入激发前0.5 h 给予药物干预，共21 d。地塞米松组每日灌胃0.125 mg·kg-1地塞米松溶液；根据前期研究[15]结果，中药组每日灌胃11.4 g·kg-1搜风愈喘方溶液；正常对照组和模型对照组每日灌胃等容量生理盐水。

1.7 观察指标

1.7.1观察大鼠一般情况 观察大鼠的精神状态、体质量、饮食情况及活动情况等。

1.7.2血清ELISA 检测 大鼠以50 mg·kg-1氯胺酮麻醉后，腹主动脉取血8 mL，4 ℃、3 000 r·min-1（离心半径13 cm）离心10 min 后分离血清，采用ELISA法测定IL-13、TNF-α 浓度，具体按ELISA 试剂盒说明书操作。

1.7.3支气管肺泡灌洗液（BALF）ELISA 检测 切开大鼠气管，插管，用一次性注射器取生理盐水8 mL 作肺泡灌洗，重复3 次，要求回收率大于75%。每份样本经4 ℃、2 000 r·min-1（离心半径13 cm）离心10 min，取上清液按ELISA 试剂盒说明书测定BALF 中IL-13、TNF-α 的含量。

1.7.4病理学观察 处死大鼠，经肺动脉插管灌注4%多聚甲醛固定，取肺组织酒精脱水石蜡包埋切片，厚度为5 μm，行苏术精伊红（HE）染色、过碘酸雪夫（PAS）染色。光镜下观察肺组织气道炎症及黏液分泌情况，参照相关研究[16]评价气道周围炎症细胞浸润情况及黏液分泌情况。

1.7.5RT-PCR 法检测相关基因表达水平 取大鼠肺组织，通过TRIzol 试剂提取总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，按说明书进行实时荧光定量PCR 检测。PCR 反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40 个循环。mRNA 的相对表达水平用2-ΔΔCt相对定量公式计算。引物序列见表1。

表1 引物序列及扩增长度Table 1 Primer sequences and amplification lengths

1.7.6Western Blot 法检测各组大鼠肺组织中ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK 的表达水平 取大鼠肺组织，提取总蛋白并测定蛋白浓度后，沸水浴加热15 min 使其充分变性；经电泳将蛋白分离，300 mA 恒流转膜后立即漂洗，加脱脂奶粉室温下封闭30 min；按照抗体说明书稀释后，加入一抗，4 ℃孵育摇床过夜，回收一抗；将二抗用TBST 按照1∶5 000 的比例进行稀释，室温下孵育30 min，经显色、曝光、显影、定影后，进行图片整理和数据分析。

1.8 统计学处理方法使用SPSS 25.0 统计学软件，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，各组数据符合正态分布且满足方差齐性，即采用单因素方差分析。方差不齐，则采用Dunnett’s T3 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况正常对照组大鼠精神状态良好，反应敏捷，饮食正常，体质量无明显变化，皮毛光亮浓密，无异常分泌物。经雾化激发后，除正常对照组外，其余各组均出现精神状态欠佳，情绪躁动，体质量明显下降，且伴不同程度的呼吸气促，打喷嚏，搔鼻等行为。经药物干预后，地塞米松组及搜风愈喘方组大鼠精神状态、饮食、呼吸急促等症状均较模型组明显改善。

2.2 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠血清中IL-13、TNF-α 含量的影响见表2。ELISA 结果显示，与正常对照组比较，模型对照组血清中IL-13、TNF-α含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型对照组比较，地塞米松组和搜风愈喘方组大鼠血清IL-13、TNF-α 含量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；地塞米松组和搜风愈喘方组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠血清中IL-13、TNF-α含量的影响（±s，n=8）Table 2 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on serum IL-13 and TNF-α content in bronchial asthma rats（±s，n=8）

表2 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠血清中IL-13、TNF-α含量的影响（±s，n=8）Table 2 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on serum IL-13 and TNF-α content in bronchial asthma rats（±s，n=8）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05

TNF-α/（pg·mL-1）9.40±0.58 25.69±5.37*17.35±7.50#16.46±3.54#组别正常对照组模型对照组地塞米松组搜风愈喘方组IL-13/（pg·mL-1）7.88±1.46 14.22±4.30*9.45±2.18#8.44±1.80#

2.3 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺泡灌洗液IL-13、TNF-α 含量的影响见表3。ELISA 结果显示，与正常对照组比较，模型对照组BALF 中IL-13、TNF-α的水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型对照组比较，地塞米松组和搜风愈喘方组大鼠BALF 中IL-13、TNF-α 的水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；地塞米松组和搜风愈喘方组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺泡灌洗液IL-13、TNF-α 含量的影响（±s，n=8）Table 3 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on the contents of IL-13 and TNF-α in alveolar lavage fluid of bronchial asthma rats（±s，n=8）

表3 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺泡灌洗液IL-13、TNF-α 含量的影响（±s，n=8）Table 3 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on the contents of IL-13 and TNF-α in alveolar lavage fluid of bronchial asthma rats（±s，n=8）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05

TNF-α/（pg·mg-1）69.56±30.14 226.12±42.89*149.31±37.67#56.33±38.45#组别正常对照组模型对照组地塞米松组搜风愈喘方组IL-13/（pg·mg-1）12.92±4.32 46.52±6.34*26.11±6.78#16.75±6.90#

2.4 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺组织病理变化的影响见图1、图2。HE 染色可见，正常对照组肺组织学结构清晰，支气管黏膜完整，肺泡膨胀良好，肺泡壁未见明显增厚。模型对照组支气管黏膜上皮脱落进入管腔，同时混杂嗜酸性黏液；支气管黏膜固有层增厚，大量淋巴细胞浸润；肺泡壁增厚，局部肺泡腔内可见巨噬细胞游出。与正常对照组比较，模型对照组肺组织炎症病变评分升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。搜风愈喘方组支气管黏膜上皮轻微脱落，管腔清晰，渗出物较少；支气管黏膜固有层炎症减轻，可见淋巴滤泡增生；周围肺泡壁轻度增厚。地塞米松组支气管内混有大量嗜酸性渗出物；周围肺泡壁明显增厚，偶见肺泡上皮细胞脱落进入肺泡腔。与模型对照组比较，地塞米松组和搜风愈喘方组的炎症病变评分均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。地塞米松组和搜风愈喘方组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺组织病理变化的影响Figure 1 Effect of Soufeng Yuchuan Recipe on pathological changes of lung tissue in bronchial asthma rats

图2 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺组织病理评分的影响（±s，n=8）Figure 2 Effect of Soufeng Yuchuan Recipe on pathological score of lung tissue in bronchial asthma rats（±s，n=8）

PAS 染色可见，与正常对照组比较，模型对照组可见肺泡壁增厚，支气管黏膜可见大量杯状细胞化生及黏液分泌，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比，地塞米松组及搜风愈喘方组支气管黏膜杯状细胞增生及黏液分泌明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；地塞米松组和搜风愈喘方组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺组织IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 基因表达变化的影响见表4。与正常对照组比较，模型对照组大鼠肺组织匀浆中IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 的mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型对照组比较，地塞米松组和搜风愈喘方组大鼠肺组织匀浆中IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 的mRNA 表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；地塞米松组和搜风愈喘方组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，搜风愈喘方可使哮喘大鼠肺组织匀浆中IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 的mRNA 表达减少，改善气道炎症反应。

表4 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺组织IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 基因表达的影响（±s，n=8）Table 4 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on expressions of IL-13，ERK1，ERK2 and p38 MAPK genes in lung tissue of bronchial asthma rats（±s，n=8）

表4 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺组织IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 基因表达的影响（±s，n=8）Table 4 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on expressions of IL-13，ERK1，ERK2 and p38 MAPK genes in lung tissue of bronchial asthma rats（±s，n=8）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05

p38MAPK 1.00±0.00 2.64±0.78*1.57±0.39#1.50±0.09#组别正常对照组模型对照组地塞米松组搜风愈喘方组IL-13 1.00±0.00 2.54±0.78*1.14±0.86#0.12±0.09#ERK1 1.00±0.00 1.79±0.23*1.21±0.10#121±0.30#ERK2 1.00±0.00 2.14±0.58*1.36±0.05#1.09±0.14#

2.6 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺组织p-ERK、p-p38 MAPK 的蛋白表达的影响见图3。Western Blot 结果显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肺组织中p-ERK、p-p38 MAPK 的蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型对照组比较，地塞米松组和搜风愈喘方组大鼠肺组织中p-ERK、p-p38 MAPK 的蛋白表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；地塞米松组和搜风愈喘方组比较，肺组织中p-ERK、p-p38MAPK 蛋白表达的差异无统计意义（P＞0.05）。结果表明，搜风愈喘方可在一定程度上抑制p-ERK、p-p38 MAPK 蛋白的表达。

图3 搜风愈喘方对支气管哮喘大鼠肺组织p-ERK、p-p38 MAPK 蛋白表达的影响Figure 3 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on protein expressions of p-ERK and p-p38 MAPK in lung tissue of bronchial asthma rats

3 讨论

支气管哮喘是以气道重塑、气道炎症、平滑肌功能紊乱为主要病理改变的慢性气道炎症性呼吸系统疾病，通常具有不同的临床表型。在目前对哮喘的认识中，气道炎症是其本质，基本特征是气道高反应性（airway hyperresponsiveness，AHR），而气道重塑是造成哮喘反复发作、迁延难愈的根本原因，它主要是由于反复慢性炎症刺激、支气管弹性损伤导致管壁不可逆性的病理改变[15]。在治疗方面，哮喘全球防治创议提出哮喘的治疗目标在于良好的控制症状，维持正常生活水平，减少药物不良反应、急性发作和死亡[17]。国内外哮喘最新指南中均把糖皮质激素作为哮喘治疗的一线用药，但不良反应较多，患者依从性较差，对于其是否可直接或间接通过减轻炎症抑制或逆转气道重塑，目前仍存在争议，故对气道炎症的发生机制以及药物干预的研究尤为重要。崔彬等[18]发现射干麻黄汤可从改善气道炎症、调节Th1/Th2 平衡及神经源性因子多个发病环节对哮喘进行干预。李厚忠等[19]发现中药川贝母可通过抑制MMP-2，MMP-9 和TIMP-1，改善哮喘症状。朱颖涛等[20]发现马鞭草苷可干预哮喘大鼠的气道炎症及气道重塑，发挥抗哮喘的作用。因此，中医药对气道调控作用的积极探索对支气管哮喘的临床施治具有重要意义。

传统中医学将支气管哮喘归为“哮证”“喘证”的范畴，并认为“内有壅塞之气，外有非时之感，膈有胶固之痰”为哮喘的主要病机。但随着社会进步，现代医家对哮喘的病机有了新的阐释。闫永彬教授通过对中西医哮喘理论进行研究，提出“伏风暗瘀宿痰”的哮喘病机理论，并创立验效于临床的祛风、化痰、活血法并施的“搜风愈喘方”[6]。“知药不如知方，知方不如守法，守法不如明理”，搜风愈喘方正是基于对哮喘病机“明理”进行的系列研究，方中白僵蚕、蝉蜕、地龙，乃遵叶桂“久则邪正混处其中，草木不能见效，当以虫蚁疏逐”之训，合橘络搜风通络，以搜深伏肺络之风邪，党参补气健脾，和以甘草益气健脾，助血运行；红花活血消暗瘀；山楂、莱菔子化食消滞；礞石、炙麻黄、杏仁、炙枇把叶化痰降气以平喘咳。本研究结果显示，地塞米松组和搜风愈喘方组大鼠在实验过程中的饮食、精神等一般情况比模型对照组有所改善，肺组织病理损伤明显缓解，从宏观和微观证实了搜风愈喘方对哮喘大鼠气道炎症的治疗作用。

丝裂素活化蛋白激酶家族（MAPKs）是重要的细胞信号转导系统，在调节细胞生长、增殖、分化、凋亡及细胞间功能同步等过程有重要作用，在介导炎症反应中也具有关键性作用[21]。ERK、JNK 及p38MAPK 均是MAPKs 信号通路中的关键成员，其磷酸化可以激活包括转录因子在内的多种效应蛋白[22]。p38MAPK 是炎症反应的关键参与者，可加重炎症细胞在炎症部位的聚集，继而加剧炎症反应。TNF-α 作为一种多功能炎性因子，与p38 通路激活密切相关[23]。研究[24-25]发现TNF-α 可通过激活信号通路p38MAPK，致中心粒细胞大量趋化、黏附、集聚于气道黏膜以及肺组织，加重气道局部损伤及血管内皮损伤，从而加重慢性气道炎症，而活化的p38MAPK 激活的信号通路会产生大量TNF-α，进而再次推动p38MAPK 信号通路的活化，形成正反馈循环。ERK 信号转导通路是体内多种信号通路的汇合点，其作用主要是介导细胞的增殖与分化。气道重塑可由ERK 长期反复磷酸化引起的生长和增殖有关基因的过度表达形成[26]。IL-13 在哮喘的气道炎症和气道重塑中发挥着至关重要的作用，可通过遗传基因、受体复合物、信号通路来对哮喘的发病进行调控[27]。ERK1/2 可在以不依赖于STAT6 的方式被IL-13激活，从而促进IL-13 诱导的炎症反应和细胞重塑，因此ERK1/2 调节因子可能有助于治疗IL-13 诱导的疾病[28]。Duan 等[29]发现哮喘小鼠肺组织中P-ERK 的表达明显增高，刘先胜等[30]发现哮喘大鼠T 淋巴细胞ERK 的表达和活性上调，IL-13 蛋白水平上升，ERK参与了Th2 细胞IL-13 的调控。本研究中搜风愈喘方组大鼠血清及BALF 中IL-13 和TNF-α 的含量明显降低，肺组织中ERK、p38MAPK 的基因表达明显下降，由此可推测搜风愈喘方是通过ERK/p38MAPK信号通路实现对支气管哮喘大鼠气道炎症的干预作用。

综上所述，在支气管哮喘大鼠模型中，搜风愈喘方可以明显抑制炎症因子的释放，这可能与其抑制ERK 和p38MAPK 信号激活有关，进一步验证了哮喘“伏风暗瘀宿痰”中医病机假设的合理性，并有助于阐明中西医病机交通性，为突破哮喘中医病机“瓶颈”，实现中医药辨证哮喘和精准干预哮喘提供实验依据。