携带鼠GM-CSF基因的穿梭质粒抗结肠癌作用研究*

苏红霞,蔡林康,刘滨磊,李炎坤**

(1.湖北科技学院药学院鄂南特色中药湖北省工程研究中心,湖北 咸宁 437100;2.武汉滨会生物科技股份有限公司;3.湖北工业大学)

结直肠癌(CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤,预计到2030年,CRC的全球负担将增加60%,新病例达到并超过220万,死亡人数达到110万例[1]。机体免疫系统不能有效识别肿瘤抗原是肿瘤发生的主要原因之一。近年来随着肿瘤免疫逃避机制的进一步明确,人们不断探索靶向肿瘤免疫逃避的干预措施,重新调动免疫应答,吸引免疫细胞进入肿瘤组织让“冷肿瘤”变为“热肿瘤”,恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应。

细胞因子是一种控制免疫细胞的发育,由免疫细胞介导的多效性多肽,可以对抗肿瘤免疫抑制,激活肿瘤免疫细胞[2]。已有研究表明[3],粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(ganloye-macrophage colory simulating fetor,GM-CSF)对结直肠肿瘤细胞生长有直接抑制的作用。GM-CSF通过诱导细胞周期的G0/G1期停滞来抑制恶性肿瘤细胞的增殖,并促进它们的分化[4]。然而,GM-CSF在体内抑瘤的效果仍有待探讨。

在肿瘤微环境内高效表达细胞因子需要良好的载体。病毒载体转染效率高,但易受免疫原性的影响,引发严重的免疫反应和炎症反应,靶向性较差,且成本较高。腺病毒载体由于其高度免疫原性衣壳而触发严重免疫应答的能力,可能导致病毒失活并阻碍转基因的系统传递,使其应用受到了限制[5-6]。早在1990年,就有文章报道质粒载体是一种极具前景的体内转染载体,表达荧光素酶的DNA分子在小鼠体内表达时间可长达两个月[7]。质粒DNA载体较为安全,可诱导广泛的免疫反应,也不存在任何与复制微生物相关的风险,而直接瘤内注射质粒的方式减少了扩散和泄露,且增加了对主要病灶的免疫原性。

本实验用CT26-IRFP肿瘤细胞皮下接种BALB/c小鼠建立肿瘤动物模型,用穿梭质粒pT7 mGM-CSF注射小鼠瘤内,观察GM-CSF基因免疫治疗小鼠结肠癌的效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物和细胞

6～7周龄雌性BALB/c小鼠购于湖北省实验动物研究中心(合格证编号42000600043578)。CT26-IRFP细胞由本实验室通过PiggyBac转座子系统将近红外荧光蛋白IRFP 720转入鼠结肠癌细胞CT26细胞株,并通过嘌呤霉素筛选获得CT26-IRFP 720单克隆细胞株[8]。

1.1.2 主要试剂与仪器

ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit重组克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司);氨苄青霉素(德国biofrox);大肠杆菌DH5α(赛默飞世尔科技有限公司);lipofectamine3000购自(赛默飞世尔科技有限公司);胎牛血清(四季青公司);胰酶(美国Gibco公司);DME/F-12培养基(美国Hyclone公司);肌醇山梨醇缓冲液(IS Buffer)(武汉塞维尔生物科技有限公司);PBS(南京生航生物技术有限公司);苏木素染液(武汉塞维尔生物科技有限公司);一抗CD3(武汉塞维尔生物科技有限公司);一抗CD11b(武汉塞维尔生物科技有限公司);HRP标记山羊抗兔组化试剂盒DBA显色剂(武汉塞维尔生物科技有限公司)。

细胞计数仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);基因扩增仪和二氧化碳培养箱(日本松下公司);恒温水浴锅(新苗生物科技有限公司);倒置荧光显微镜(日本Olympus Corporation);生物安全柜(青岛海尔集团公司);-70℃低温冰箱(青岛海尔集团公司);高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司);小动物活体成像系统(PE珀金埃尔默股份有限公司);包埋机(武汉俊杰电子有限公司);病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 质粒构建与表达

pT7载体由本实验室提供,根据目的基因GM-CSF序列设计引物,引物序列以XX基因组序列为模板扩增,PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测条带大小正确后,将目的片段进行产物回收。载体pT7以及目的基因GM-CSF的PCR产物用ClonExpress技术进行同源重组。将连接产物转化进大肠杆菌DH5ɑ,利用氨苄青霉素进行阳性克隆筛选,得到pT7 mGM-CSF后,DNA测序检测载体正确性。

将质粒通过lipofectamine3000转染试剂转染293T细胞,收集细胞上清,用Elisa验证抗原的表达,重复实验5次。

1.2.2 细胞培养

CT26-IRFP细胞用含有10%胎牛血清的DME/F-12培养基接种后,将细胞放置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养,待细胞汇合度达80%～90%时,按照1∶4的比例进行细胞传代。

1.2.3 植瘤前细胞处理

对所需要植瘤的CT26-IRFP细胞进行培养,在植瘤前,收集细胞,离心条件为800g,5min,然后重悬于DME/F-12培养基中。调整CT26-IRFP细胞浓度至1×106/mL。

1.2.4 CT26-IRFP细胞植瘤

15只BALB/c小鼠饲养于配有IVC笼具及新风系统动物实验室内,饲养一周后开始实验,于BALB/c小鼠右侧肋背部皮下注射100μL含有1×106个CT26-IRFP的细胞悬液,待肿瘤生长至50～80mm3备用。

1.2.5 pT7 mGM-CSF瘤内给药实验

随机分成3组,分组见表1。CT26-IRFP荷瘤鼠在第1、4、7、10d瘤内注射80μL(200ng/μL)提取的质粒和IS buffer。

表1 pT7 mGM-CSF给药实验方案

1.2.6 量取肿瘤体积

用游标卡尺量取长径(a)一次、短径(b)两次,肿瘤体积(tumor volume)的计算公式为:V=1/2×a×b×b。

1.2.7 活体动物成像系统检测IRFP产生的荧光信号

小鼠肿瘤近红外荧光拍摄前先对小鼠进行麻醉,后将小鼠分组放入小动物活体成像系统拍摄箱,拍摄肿瘤近红外荧光表达图片。每隔7d使用小动物活体成像仪观察小鼠体内荧光表达情况,持续观察。

1.2.8 免疫组织化学检测

治疗第14d时取各组肿瘤组织,4%多聚甲醛固定过夜,脱水处理、石腊包埋、制成厚度为4～5μm的切片。免疫组化染色流程如下:石蜡切片常规脱蜡、补水处理,3%H2O2室温孵育5～10min以消除内源性过氧化物酶的活性。用组化油笔将待染组织圈好,加入10%FBS室温封闭1h,加入待测一抗,室温孵育2h,PBS洗涤,加入HRP标记IgG抗体,室温作用1h,PBS洗涤,DAB显色,自来水充分冲洗,透明,树胶封片。

1.3 统计学方法

应用Graph Pad Prism 8.01软件进行统计学分析,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 质粒pT7 mGM-CSF在真核细胞中的表达

参照lipofectamine3000使用说明书,将0.5μg的pT7 mGM CSF转染293T细胞,转染36～48h后,收集六孔板中的细胞上清,用Elisa检测mGM-CSF蛋白表达。结果显示,与pT7 GFP组和PBS组比较,pT7 mGM-CSF质粒的表达在质粒组的293T细胞上清中的含量达到600pg/mL,与其他两组有显著差异(*P<0.05)。如图1所示。

图1 Elisa测定mGM-CSF在293T细胞中的表达(*P<0.05,n=3)

2.2 质粒pT7 mGM-CSF体内抑瘤效应

研究结果显示,在CT26-IRFP皮下移植瘤模型上,pT7 GFP组和PBS组相比,质粒组动物肿瘤生长趋势更为平缓。给药第21d,与PBS比较,质粒组治疗效果明显(图2A)。在治疗28d后,pT7 mGM-CSF质粒组小鼠存活率为40%,与pT7 GFP组和PBS组相比有显著性差异(P<0.05),见图2B。

图2 CT26肿瘤生长曲线图及鼠生存曲线图

2.3 肿瘤IRFP基因在体内表达的荧光信号强度比较

小鼠肿瘤荧光趋势图和给药21d荧光强度图的数据显示在CT26-IRFP小鼠皮下移植瘤模型上,小鼠肿瘤总荧光强度和量瘤数据的趋势基本一致。肿瘤荧光强度结果显示质粒组IRFP基因表达的荧光信号与pT7 GFP组和PBS组相比都有显著性差异(P<0.05),见图3B。

图3 CT26肿瘤IRFP基因在体内表达的荧光信号强度图

2.4 质粒pT7 mGM-CSF应用有效刺激免疫细胞浸润

为了进一步探究质粒pT7 mGM-CSF的疗效,我们开展了CD3(指示T淋巴细胞)、CD11b(指示NK细胞)免疫组织化学检测,观察小鼠肿瘤组织中浸润细胞的类型。实验结果显示,与PBS组相比,质粒组的小鼠肿瘤组织内部有大量T淋巴细胞、NK细胞(图4)。提示质粒pT7 mGM-CSF能促进各种免疫细胞进入肿瘤组织、抑制肿瘤细胞的生长。

图4 肿瘤局部组织免疫组织化学(标尺=50μm)

3 讨 论

目前,肿瘤免疫监控的概念正在复兴,免疫系统可以通过各种途径激活来发挥抗肿瘤的效果。为了达到这一目标,必须提供适当的细胞因子环境,使细胞因子操作成为免疫治疗的核心。近来,国内外研究者对GM-CSF功能的研究越来越深入,尤其在肿瘤免疫治疗方面得到更多的关注。GM-CSF恢复肿瘤患者中性粒细胞驱动的免疫反应,在GM-CSF的下游免疫效应器中,中性粒细胞尤其重要,是最早对感染和癌症做出反应的免疫细胞类型之一[9]。最近,GM-CSF被证明通过激活肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞中的IRF-5来驱动抗肿瘤的CD4和CD8 T细胞免疫反应[10]。因此,GM-CSF在抗肿瘤方面的研究有必要进一步探讨。

本研究发现,pT7 mGM-CSF质粒能高效表达靶基因,明显抑制BALB/c小鼠结肠癌的生长,延长小鼠的生存期。另外,免疫组织化学结果发现,穿梭质粒pT7 mGM-CSF治疗组肿瘤组织内部有大量T淋巴细胞、NK细胞,提示穿梭质粒pT7 mGM-CSF能有效增强不同免疫细胞的趋化吸引作用,促进各种免疫细胞进入肿瘤组织、抑制肿瘤细胞的生长。但穿梭质粒在患者原代肿瘤细胞中的局限性仍然不容忽视,更值得注意的是,这项研究仅限于单个细胞系,后期仍有必要增加不同细胞系的研究并与病毒载体进行比较研究。

综上所述,瘤内注射GM-CSF基因修饰的穿梭质粒对小鼠结肠癌具有明显的抑瘤效应,可能与质粒pT7 mGM-CSF有效刺激免疫细胞浸润有关,但具体机制还需要进一步研究。本研究也为临床应用GM-CSF基因免疫治疗提供了实验依据。