SFTPB在甲状腺乳头状癌中的表达及其临床意义

李欣芳,地里呼玛尔·吐鲁洪,高虹宇,王少华

0 引 言

甲状腺是人体内最大的内分泌腺,位于颈前正中偏下,呈H形。甲状腺癌是起源于滤泡上皮细胞或滤泡旁C细胞的恶性肿瘤,近年来其发病率迅速提高。2020年甲状腺癌世界范围内发病率高居第9位,男女发病率之比约1∶4[1-2]。乳头状癌是常见的甲状腺癌类型,预后良好,10年生存率超过90%～95%[3]。然而,甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)初诊患者常伴有中央区淋巴结转移,文献报道其发生率高达30%～80%。术前准确预测淋巴结转移对于确定 PTC 患者最佳手术范围、减少疾病持续性或复发性、避免再手术并发症及改善预后等具有重要意义[4-5]。

肺表面活性蛋白B(pulmonary surfactant-associated protein B, SFTPB/SPB)是由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一类疏水性脂蛋白,在降低肺泡表面张力和宿主免疫防御方面发挥重要作用[6-8]。近年来研究发现,SFTPB不仅在维持正常生理功能上发挥作用,也与炎症性和肿瘤性疾病有关[9-11]。通过公共数据库筛选发现SFTPB在甲状腺癌中存在高表达,并通过文献检索发现有关该基因在肺癌中与淋巴结转移的相关性,由此猜测SFTPB在PTC中可能存在类似作用,并对此假设行进一步深入探索[12]。

本研究旨在通过比较PTC癌组织与癌旁正常组织中SFTPB的表达情况,及进一步比较中央区淋巴结转移与非转移患者该基因的差异表达,探讨SFTPB在预测该类患者病理良恶性及中央区淋巴结转移方面的应用价值;同时对术前cN0的患者是否需行预防性中央区淋巴结清扫提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性分析2018年6月29日-2022年6月2日于我科首诊并行手术治疗的共计123例PTC患者的临床病理基线资料及手术标本。收集指标包括符合纳入标准患者的姓名、住院号、性别、年龄、肿瘤最大径(cm)、有无中央区淋巴结转移及转移数目、是否合并桥本氏甲状腺炎、有无BRAF基因突变、是否为多灶性肿瘤、术前TSH值(正常值范围0.49～4.5 mIU/L)、TNM分期(AJCC第7版)、临床分期及取材日期。纳入标准:①术式为甲状腺全切及中央区淋巴结清扫;②术后病理证实为PTC;③术前检查未提示有肿瘤远处转移;④无其他恶性肿瘤病史;⑤无甲状腺、颈部手术及放射史;⑥临床、病理基线资料收集完整者;⑦术后癌组织(及癌旁组织)标本保存完好者;⑧HE、IHC染色后显微镜视野中存在足量肿瘤细胞者。排除标准:①术后复发于我院再次行手术治疗者;②未行中央区淋巴结清扫或仅行单侧腺叶切除及单侧VI区淋巴结清扫患者。经排除标准筛选后共计有效病例104例,共计有效标本175件(其中成对标本71件,单癌标本33件)。

1.2研究方法

1.2.1 实验试剂SFTPB兔抗人多克隆抗体购买自proteintech©公司(Catalog Number13664-1-AP),SP试剂及DAB显色试剂盒购买自Solarbio©生物公司(货号 SP0021)。

1.2.2实验方法所有石蜡标本以4 μm厚度行连续切片并于60 ℃烤箱中烤片不少于2 h。经二甲苯I、II中脱蜡10 min,后依次于无水酒精、90%、80%、70%浓度酒精中浸泡5 min水化。免疫组化染色采用En Vison两步法:柠檬酸盐缓冲液高压下抗原热修复,PBS、PBST溶液依次清洗各5 min。室温下封闭液封闭1 h后,按推荐浓度1∶50稀释SFTPB兔多克隆抗体,以50 μL体积孵育标本,4 ℃过夜。PBS、PBST清洗后,依次滴加1∶100稀释浓度的Bio-羊抗兔二抗、链霉亲和素-POD工作液各50 μL,孵育30 min后清洗。滴加DAB显色液后于显微镜下观察染色情况,显色约10 min后终止;再行苏木精复染,常规脱水透明后用中性树胶封片。干燥后于显微镜400倍视野下随机选取不少于5个视野拍照,最后根据图片中目的蛋白表达量行人工半定量评分及Image-Pro Plus软件(Version 6.0.0版本)定量评分。

1.2.3结果判读SFTPB蛋白阳性着色主要定位于甲状腺滤泡上皮细胞的胞质内,阳性染色呈棕黄色或棕褐色[13-14]。

1.2.4半定量评分染色强度计分标准为:0分为阴性着色;1分为淡黄色;2分为浅褐色;3分为深褐色。染色范围计分标准为:0～25%为1分;26%～50%为2分;51%～75%为3分;76%～100%为4分。评分记为2项指标的乘积,取5个视野下评分的均值作为最后得分。0～3.0分记为阴性(-),3.1～6.0记为弱阳(+),6.1～9.0记为阳(2+),9.1～12.0记为强阳(3+)。染色结果判读由2位研究者独立完成。

1.2.5Image-Pro Plus定量评分所得图片经IPP软件进行光密度校正,手动选取视野下所有阳性颜色区域,所获取的累积光密度值(integrated optical density,IOD)除以有效目标分布区域面积总和即为平均光密度值(average optical density,AOD),取5个视野下的平均值作为最后得分。

1.3生物信息学分析于TCGA公共数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下载有关甲状腺乳头状癌患者的临床病理资料,采用limma包进行PTC癌组织和癌旁组织SFTPB表达量的配对分析。利用GEPIA(http://gepia2.cancer-pku.cn)在线网站进行SFTPB高、低表达组的DFS生存差异分析。

2 结 果

2.1 临床病理基线资料本研究共计收集104例患者有效临床病理信息及手术标本。根据是否发生中央区淋巴结转移将纳入研究患者分为转移组(n=70)和未转移组(n=34)。组间患者性别、年龄、肿瘤最大径、多灶性、临床分期差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表 1 104例PTC患者的临床病理基线资料Table 1 Clinicopathological baseline data of 104 patients with PTC

2.2SFTPB在甲状腺乳头状癌中的表达通过对71对PTC癌组织与相应癌旁组织样本的对比分析发现,癌中SFTPB的表达量明显高于正常组织,见图1。其中,在半定量评分比较标准中,癌组织中目的蛋白阴性表达者2例(2.8%),阳性表达者69例(97.2%);癌旁组织中目的蛋白阴性表达者为66例(93%),阳性表达者5例(7%)。在定量评分比较中,癌组织的目的蛋白表达量为42.58±21.71,癌旁组织样本为10.56±6.31,差异有统计学意义(P<0.001)。

图 1 PTC癌组织、癌旁组织的HE染色及免疫组化染色Figure 1 HE staining and immunohistochemical staining of PTC cancer tissues and para-cancerous tissues

为扩大样本量验证以上结论的准确性,对比分析了TCGA网站上的公共数据,同样发现配对样本中癌组织的SFTPB表达量高于癌旁组织,且SFTPB高表达组较低表达组的预后(DFS)更差(P=0.038)。见图2。

a:SFTPB表达; b:生存率图 2 基于公共数据库的SFTPB的差异表达和预后意义Figure 2 Differential expression and prognostic value of SFTPB based on public database

2.3SFTPB与中央区淋巴结转移的关系存在中央区淋巴结转移的PTC(n=70)较中央区淋巴结转移阴性组(n=34)而言,SFTPB蛋白的表达量进一步增加。其中,在半定量评分标准中,转移组的目的蛋白表达阳/强阳表达者为50例(71%),阴/弱阳表达者为20例(29%);未转移组中目的蛋白阳/强阳性表达者为3例(9%),阴/弱阳表达者为31例(91%)。在定量评分中,转移组的目的蛋白表达量为48.45±19.07,未转移组的表达量为25.29±9.69(P<0.001)。提示SFTPB的表达量升高可能对中央区淋巴结转移具有驱动作用。

2.4PTC患者临床病理特征与中央区淋巴结转移的关系单因素逻辑回归分析显示,性别(P<0.001)、年龄(P=0.004)、多灶性(P=0.027)、SFTPB半定量(P<0.001)、SFTPB定量(P<0.001)是颈部中央区淋巴结转移的相关临床病理因素;多因素

分析结果进一步提示,性别(P=0.045)、年龄(P=0.034)、SFTPB半定量(P=0.021)、SFTPB定量(P=0.028)是颈部中央区淋巴结转移的独立预后因素。其中,男性、年龄≤45岁、SFTPB高表达患者中央区淋巴结转移的风险较高,为预后不良因素。见表2。

表 2 PTC颈部中央区淋巴结转移相关临床病理参数的单因素和多因素Logistic回归分析Table 2 Univariate and multivariate logistic regression analysis of clinicopathological parameters related to lymph node metastasis in the central region of the neck of PTC

2.5基于独立预后因素构建患者中央区淋巴结转移的预测模型通过四个因素(性别、年龄、SFTPB半定量、SFTPB定量)构建的列线图所示,SFTPB表达量在图中显示为预测甲状腺癌中央区淋巴结转移最有效的指标,见图3;且表达水平越高其预测效能越佳。其他如性别、年龄也可对转移进行一定预测。在ROC曲线中,SFTPB半定量与定量的曲线下面积分别为0.922和0.929,显示出良好的预测性能,上述结论在决策曲线中同样得到验证,展现了SFTPB在预测中央区淋巴结转移上良好的临床效用性,提示SFTPB有望成为PTC患者的新型诊断标志物,并在预测中央区淋巴结转移中发挥有效作用,见图4。

a:SFTPB半定量; b:SFTPB定量图 3 SFTPB蛋白在癌旁组织、pN0、pN1各组中的表达量比较Figure 3 Comparison of the expression of SFTPB in the para-cancerous , pN0 and pN1 groups

a:由性别、年龄、SFTPB半定量与定量4因素建立的预测中央区淋巴结转移风险的列线图;b:基于列线图的预测模型校准曲线;c:评估预测模型准确性的ROC曲线图;d:评估预测模型效用性的DCA曲线图图 4 相关临床病理因素对中央区淋巴结转移的预测效能Figure 4 Predictive efficacy of relevant clinicopathological factors about central lymph node metastasis

3 讨 论

随着常规体检的普及和影像学诊断技术的进步,甲状腺癌的发病率迅速增高,其中又以甲状腺微小癌尤甚。甲状腺癌以PTC最为常见,占80%～85%。甲状腺乳头状癌预后良好,但临床上易早期发生中央区淋巴结转移,文献报道其发生率可高达30%～80%[15-16]。尽管颈部淋巴结清扫已在临床广泛开展,但就是否行中央区淋巴结清扫以及清扫范围,则一直存在争议。虽然预防性的清扫可以获得准确的淋巴结转移信息,但却增加了短暂性/长久性的喉返神经损伤及甲状旁腺功能减退的发生率,且没有足够的证据表明预防性的手术清扫可使患者远期生存获益[17-18]。在手术范围上,我们力争既要避免因淋巴结清扫范围不足而导致的肿瘤复发,也要避免因清扫范围过度而损伤患者旁腺及发声功能,以及影响患者正常的颈部活动和局部美观性[19-20]。因此,甲状腺乳头状癌的淋巴结清扫范围亟待规范。

人SFTPB基因位于2号染色体上,其编码的蛋白全长由381个氨基酸残基构成,相对分子质量为42 000。SFTPB主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞合成和分泌,是构成肺表面活性物质的重要组成成分,存在于哺乳动物肺泡表面气-液交界处,在维持正常呼吸功能、防止肺泡塌陷和免疫病原微生物感染方面起重要作用[21-23]。该蛋白同时与机体病理过程息息相关,如文献报道SFTPB低表达或功能异常与新生儿呼吸窘迫综合征、成人急性呼吸窘迫综合征/急性肺损伤以及老年人慢性阻塞性肺疾病的发生发展有关[24-28]。近年来,也有相关文献表明SFTPB的异常表达与恶性肿瘤的发生或预后也存在关联。管鑫等[29]通过分子结构分析与化学预测证明SFTPB基因失调对肺鳞癌的易感性;Moreno-Rubio等[30]通过对晚期非小细胞肺癌患者的多中心SFTPB转录水平检测分析发现,SFTPB mRNA低表达与患者的3年OS降低有关;Zhu等[31]对公共数据库中经免疫治疗的肺腺癌患者行凋亡相关基因差异分析发现,SFTPB表达量与预期生存存在正性相关。因此,本研究拟探索SFTPB在甲状腺乳头状癌中的表达情况及相关临床意义,丰富该基因在甲状腺肿瘤领域的研究。

本研究通过分析2018年6月至2022年6月于我科行手术治疗的104例PTC患者的手术标本及相关临床病理信息,免疫组化实验检验其SFTPB蛋白表达量对比发现,癌旁正常组织、癌组织不伴中央区淋巴结转移、癌组织伴中央区淋巴结转移3组标本的目的蛋白表达量存在显著差异,提示SFTPB在PTC癌组织中表达量升高,并可能与中央区淋巴结转移存在相关性。进一步经回归分析验证SFTPB表达量与患者性别、年龄共同构成PTC患者中央区淋巴结转移的独立影响因素。同时,我们使用Kaplan-Meier法分析TCGA共同数据库数据发现,SFTPB的高水平表达与患者的不良预后亦存在关联。

本研究也存在一定的局限性:首先,本研究为单中心数据,样本量偏小,可能使结果存在一定误差;并且,本研究收集到的存在包膜侵犯、血管/神经侵犯、腺体外肿瘤结节形成的病例较少,故未纳入统计变量当中。其次,本研究中使用的手术标本时间跨度偏长,可能存在由于样本保存条件不当而使部分实验结果产生偏差的问题。最后,本研究仅考虑了目的蛋白SFTPB与中央区淋巴结转移的可能关系,而未考虑其可能与颈侧区淋巴结转移的可能相关性,以上均有待在后续研究中进行改进或完善,以期为临床诊疗提供有效参考。

综上,甲状腺乳头状癌患者SFTPB蛋白表达量上调,且PTC合并颈部中央区淋巴结转移患者SFTPB表达水平较非转移者进一步升高。这预示SFTPB有望成为PTC潜在的诊断标志物,且在指导是否对cN0的患者行预防性中央区淋巴结清扫中发挥一定作用,有利于降低患者复发率或避免过度医疗。