Piezo1在人鼻黏膜及鼻息肉组织中的表达与临床意义

李雪梅,徐新运,顾亚军,王会会,陈 银,李 敏,徐峥嵘,魏先梅,王涵东,俞晨杰,高 下

0 引 言

鼻腔作为呼吸道的门户和通道,对呼吸气流在体外与体内的接触起重要作用。鼻黏膜面积广阔,且毛细血管和腺体丰富。鼻黏膜不仅能感受吸入鼻腔内气体的气流分布,而且能调节吸入气体的温度和湿度,这对于维持鼻腔正常生理功能至关重要。经鼻腔处理的呼吸气流会进入肺部进行气体交换,肺在此过程中会受到广泛而重复存在的机械力作用[1]。鼻黏膜在呼吸过程中可能同肺一样受到类似的机械力作用,并通过感受这种机械力作用参与维持鼻腔正常生理功能。

机械敏感性离子通道是一类将机械刺激转化为电化学信号的离子通道,在信号转导中占有重要地位,并且该类通道广泛分布于不同物种和多种组织器官中,并参与各种生理过程[2]。Piezo家族,包括Piezo1和Piezo2,是2010年Coste等在小鼠神经母细胞瘤细胞中发现的一种机械敏感性阳离子通道[3]。在背根神经元中可观察到Piezo2的强表达,并被认为是介导触觉的传感器,而Piezo1在哺乳动物各种组织中更是广泛存在表达,包括骨、膀胱、结肠、肾、肺和皮肤中都已证实Piezo1的存在,并发现其参与多种生物功能调控[4-12]。然而Piezo1在鼻黏膜组织中的表达、定位和功能尚无研究报道。本研究通过对Piezo1在人鼻黏膜及鼻息肉组织中的表达与定位进行分析,为进一步研究鼻黏膜组织是否可能通过Piezo1感知机械张力变化及具体机制研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床标本选取2021年8月至2022年9月南京鼓楼医院耳鼻咽喉头颈外科行鼻内手术的14例患者的下鼻甲、中鼻甲和鼻息肉组织标本。该研究已获得南京鼓楼医院伦理委员会批准(批准号:2022-622-01),患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂兔抗人Piezo1抗体(15939-1-AP)购自Proteintech,SP试剂盒(SPN-9002)及DAB试剂盒(ZLI-9019)购自中山公司,Trizol(R0016)购自碧云天公司,逆转录试剂盒(K1622)购自Thermo Fisher,2*SYBR Green(Q711)购自诺唯赞公司。

1.3方法

1.3.1 HE染色将下鼻甲、中鼻甲和鼻息肉组织标本经4%多聚甲醛固定24 h后,经石蜡包埋,连续切片4 μm厚,并用苏木精-伊红(HE)染色。

1.3.2免疫组化染色根据SP试剂盒说明制备鼻黏膜和鼻息肉切片进行免疫组织化学染色。将载玻片与Piezo1抗体在4 ℃孵育过夜。孵育一抗后,将切片与SP标准试剂盒中的二抗在37 ℃孵育30 min。最后,切片用DAB显色,苏木精复染。使用光学显微镜观察组织。阳性细胞表达为棕黄色,低倍镜下观察阳性细胞表达区域,在阳性表达区域随机选取10个高倍镜视野(400×)并使用Image-J图像分析软件进行分析处理,根据积分光密度值(IOD)/面积计算平均光密度值(AOD)以确定染色强度。

1.3.3RT-qPCR实验取鼻黏膜和鼻息肉组织的RNA使用Trizol进行提取,使用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)鉴定RNA 浓度和质量后,使用逆转录试剂盒和PCR仪进行逆转录。使用 SYBR Green和QuantStudio3系统进行RT-qPCR的定量检测。Piezo1和内参对照GAPDH的引物序列见表1。采用 2-ΔΔCt法计算各组织中Piezo1 mRNA 相对表达量。

表 1 RT-qPCR引物序列Table 1 The sequences of the primers for RT-qPCR

2 结 果

2.1 组织病理学上鼻息肉与鼻黏膜的比较与下鼻甲和中鼻甲组织相比,鼻息肉间质呈现高度水肿,结构十分松散。同时,下鼻甲和中鼻甲组织腺体密集,而鼻息肉中腺体的分布显著减少。此外,鼻息肉的表面上皮结构也明显不同于下鼻甲和中鼻甲,鼻息肉上皮结构紊乱且纤毛明显脱落,下鼻甲和中鼻甲上皮结构整齐有序且纤毛完整。见图1。

2.2Piezo1在鼻息肉、下鼻甲和中鼻甲组织的腺体、纤毛和血管内皮细胞中的表达免疫组化染色结果显示,下鼻甲、中鼻甲和鼻息肉均存在Piezo1的阳性染色分布,其中固有层腺体、上皮层纤毛细胞和血管内皮细胞为Piezo1阳性表达的主要区域。并且Piezo1在下鼻甲和中鼻甲中阳性细胞的表达(0.44±0.01、0.43±0.03)较鼻息肉阳性细胞的表达(0.27±0.02)显著增加(P<0.001)。见图2。

黄色箭头示Piezo1在腺体的表达;黑色箭头示在纤毛的表达;红色箭头示在血管内皮细胞的表达图 2 Piezo1在鼻息肉、下鼻甲和中鼻甲中的表达( ×400)Figure 2 Expression of Piezo1 in nasal polyps, inferior turbinate and middle turbinate( ×400)

2.3下鼻甲和中鼻甲的Piezo1表达水平较鼻息肉显着增加RT-qPCR检测结果显示,Piezo1在下鼻甲、中鼻甲的mRNA表达水平(1.72±0.21、2.17±0.09)较鼻息肉(1.02±0.19)显著增加(P<0.001)。这与在免疫组化中观察到的结果一致。

3 讨 论

Piezo1的三聚体螺旋桨状结构使其敏感性地响应局部膜曲率和张力变化,触发机械转导,激活细胞内信号通路,从而导致各种细胞反应[13-14]。本研究发现,Piezo1在下鼻甲和中鼻甲的固有层腺体、上皮层纤毛细胞和血管内皮细胞均有表达,其中腺体中表达丰富,主要位于粘液腺和浆液腺,提示Piezo1参与维持鼻黏膜正常生理功能。

Piezo1在腺体中丰富表达,提示Piezo1 可能与腺体功能有关。有研究表明机械刺激可激活I型肺泡细胞的Piezo1触发ATP释放和旁分泌刺激II型细胞分泌表面活性物质[15]。在泌尿系统中也有研究表明Piezo1可能通过影响水通道蛋白2(AQP2)的运输进而影响集合管的尿液稀释和尿素浓度,参与渗透压调节[16]。分布在腺体的Piezo1很可能通过感受黏膜表面液体的张力变化刺激腺体分泌,同时可能通过影响其他离子通道如水通道蛋白等起到调控液体分泌,水和各种离子重吸收,维持细胞内外液体平衡等作用。

纤毛细胞中同样观察到Piezo1的阳性表达,提示Piezo1可能与感受和调控纤毛运动有关系。鼻黏膜的黏液-纤毛系统是上呼吸道重要的防御体系,纤毛规律摆动为鼻黏膜表面的黏液向鼻咽部运动提供动力,纤毛运动对维持鼻腔生理功能极为重要。有研究表明ATP可刺激体外培养的人鼻腔纤毛摆动频率升高,NO(一氧化碳)和钙离子也与鼻黏膜纤毛运动的调控密切相关[17-19]。众多研究表明当机械力刺激时激活Piezo1开放时,导致细胞膜去极化,Ca2+内流,激活内皮细胞释放ATP及内皮型一氧化氮合酶(eNOS),参与合成NO、调节血管张力及血压等[20-22]。有研究支持Piezo1与[Ca2+]i/钙蛋白酶机制相关,并以此解释哮喘中末端气道内源性呼吸末正压(iPEEP)的状态[23]。鼻黏膜的Piezo1可能同样通过释放ATP和增加[Ca2+]内流直接或间接导致鼻黏膜纤毛摆动速度和传输速率增加,进而增强黏液-纤毛系统的清除功能,参与维持鼻黏膜正常生理功能。

Piezo 1在鼻黏膜的血管内皮细胞的阳性表达提示Piezo1参与调节血管内皮细胞功能。有研究证实Piezo1在小鼠血管内皮细胞中表达,且在胚胎发育中促进血管发育和重塑[24-25]。也有研究表明Piezo1在肺泡毛细血管内皮细胞中响应肺泡机械拉伸作用激活钙蛋白酶,维持肺泡-毛细血管屏障的稳定,同时另一项研究也证实Piezo1在维持肺内动脉血管张力的作用[26-27]。表达在鼻黏膜血管内皮细胞中的Piezo1可能同样参与重塑小血管和维持血管内皮细胞形态等。

免疫组化和RT-qPCR定量结果证实Piezo1在鼻息肉中的表达较下鼻甲和中鼻甲明显降低。鼻息肉组织病理学标志主要为间质水肿和表面上皮细胞结构改变,腺体的数量明显减少,而Piezo1主要表达在鼻黏膜的固有层腺体、上皮层纤毛细胞和血管内皮细胞中,因此造成Piezo1在鼻息肉、下鼻甲和中鼻甲中的表达差异可能与鼻息肉组织上皮屏障被破坏及腺体散布减少有关。

本研究证实Piezo1在人鼻黏膜及鼻息肉中存在表达,且下鼻甲和中鼻甲表达较鼻息肉明显升高,对鼻腔正常生理功能的维持很可能极为重要。目前关于Piezo1的研究处于初步阶段,对其发挥的作用及调控机制仍不明确。研究Piezo1在鼻黏膜及鼻息肉中的表达利于更好了解鼻黏膜生理功能的作用机制,为鼻部疾病的临床治疗提供新的思路。