探讨基质效应、标曲定量方式对餐饮食品中5 种生物碱定量结果的影响

林晓明，许琨琨，蔡振世，庄秋虹，庄庆彬

（泉州市食品药品检验所，福建泉州 362000）

以罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因等为主要成分[1]的罂粟壳中的多种生物碱可以让食品增味提鲜，使顾客上瘾，让人嗜睡和性格改变，长期食用会引起精神失常，出现幻觉甚至慢性中毒[2-3]。尽管我国法律明令禁止在食品中添加罂粟壳，有关部门对在食品中添加罂粟壳的行为采取高压打击态势，但某些不法商贩，为了“回头客”，利用罂粟壳的成瘾特性，将其添加在羊肉汤、火锅底料、麻辣烫等餐饮食品中，从而增加客流量，严重危害人们的身心健康[4-5]。

目前，在5 种生物碱的检测中，相比以往固相萃取法、氯仿萃取法等前处理方法，QuEChERS 前处理方法更快速、便捷、有效，广泛应用于多数检测领域，也用于罂粟壳中多种生物碱的检验检测[3,6-7]。笔者发现不同的标准曲线定量方式会直接影响最终的定量结果，基于此对基质效应和标曲定量方式对5 种生物碱中的影响展开研究探讨，同时建立一种高效QuEChERS-UPLC-MS/MS 方法，一次性同时检测羊汤、火锅汤和水煮鱼汤等多种餐饮食品中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因5 种生物碱含量，以供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

GM200 高 速 磨 碎 机，Retsch；XSE205DU 电子天平，梅特勒托利多仪器有限公司；LPD2500 多管旋涡混合仪，莱普特科学仪器（北京）有限公司；LAB DANCER S25 漩涡混匀器，艾卡（广州）仪器设备有限公司；Tissuelyser-96LGM 多样品组织研磨仪，上海净信实业发展有限公司；3-15 离心机，曦玛离心机（扬州）有限公司；TurboVap LV 全自动氮吹仪，Biotage；Triple Quad 5500 三重四极杆液质联用系统，美国爱博才思公司。

1.2 材料与试剂

样品：羊汤、火锅汤、水煮鱼汤，均在泉州市区各小吃店的餐饮食品随机采购。

试剂：乙腈（默克，色谱纯）；甲醇（默克，色谱纯）；甲酸（ROE，色谱纯）；乙酸铵（Fisher Chemical，色谱纯）。盐酸可待因（中检院，批号：171203-201808，100 mg）；吗啡（中检院，批号：171201-201825，100 mg）；蒂巴因（中检院，批号：171216-201805，50 mg）；那可丁（中检院，批号：171224-201605，100 mg）；盐酸罂粟碱（中检院，批号：171214-201906，100 mg）；甲醇中可待因-D3 溶液（First Standard®，批号：S107027，100 μg·mL-1）； 甲 醇 中 吗 啡-D3 溶 液（First Standard®，批号：S102043，100 μg·mL-1）。

材料：高效QuEChERS 样品前处理试剂盒[青云化学科技有限公司，型号：CQ11-3（萃取管+盐包+净化管），批号：20230323-004]。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱和质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH HILIC（2.1 mm×150 mm，1.7 µm）；流 动 相：A 相为含0.1%甲酸的10 mmol·L-1乙酸铵溶液，B 相为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱（见表1）。柱温：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样量：2 µL。

表1 梯度洗脱程序

（2）质谱条件。离子源：ES（I电喷雾离子源），正离子模式采集；扫描方式：多反应监测MRM；气帘气（CUR）：20 psi；离子化电压（IS）：5 500 V（正离子模式）；温度（TEM）：500 ℃；喷雾气（GS1）：50 psi；辅助加热气（GS2）：50 psi；各化合物质谱参数见表2。

表2 5 种生物碱的质谱参数

1.3.2 对照品及样品溶液的制备

（1）混合对照品溶液的制备。对照品储备液：精密称取吗啡、盐酸可待因（以下简称可待因）、蒂巴因、那可丁和盐酸罂粟碱（以下简称罂粟碱）对照品适量，分别置于25 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度均为100 µg·mL-1的对照品储备液。

混合对照品溶液A：精密吸取吗啡、可待因各1 000 µL 和那可丁、蒂巴因、罂粟碱各200 μL 于20 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，得吗啡、可待因浓度为5 μg·mL-1和那可丁、蒂巴因、罂粟碱浓度为1 µg·mL-1的混合对照品溶液A。

混合对照品溶液B：精密吸取100 µL 混合对照品溶液A于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，得吗啡、可待因浓度为50 ng·mL-1和那可丁、蒂巴因、罂粟碱浓度为10 ng·mL-1的混合对照品溶液B。

同位素内标混合对照品工作溶液（5 µg·mL-1）：精密吸取吗啡-D3 和可待因-D3（对照品浓度均为100 µg·mL-1）各1 000 µL 置于20 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得吗啡-D3 和可待因-D3 浓度均为5 µg·mL-1的混合内标溶液，备用。

混合标准工作液制备：以乙腈为溶剂，精密吸取混合对照品溶液B 适量，逐级稀释成质量浓度 为0.20 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1的那可丁、蒂巴因、罂粟 碱 和 质 量 浓 度 为1.00 ng·mL-1、2.50 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1、25.00 ng·mL-1的吗啡、可待因混合标准工作液，备用。

（2）样品溶液的制备。每种样品平行称取2 g（精确至0.01 g），分别置于50 mL CQ11-3 萃取管（内含NaCl 500 mg）中，加入5 mL 水振摇混匀，再加入溶剂乙腈15 mL，涡旋振摇混匀1 min 左右，加入CQ11-3 盐包（内含MgSO45 g 和NaAc 2 g），剧烈振荡1 min，用5 000 r·min-1离心机离心5 min，取上清液8 mL 至CQ11-3 净化管（内含PSA 300 mg、C18500 mg 和MgSO41 500 mg）中，涡旋混匀1 min 左右，再经5 000 r·min-1离心机离心5 min，移取上清液适量经0.22 μm 有机滤膜，按1.3.1 方法进样。

（3）溶剂混合标准工作曲线制备。取5 支10 mL玻璃试管，均加入同位素内标混合对照品工作溶液（5 µg·mL-1）20 µL，再依次加入1 mL 相应质量浓度的混合标准工作液，复溶混匀（见表3），过0.22 μm有机滤膜，按1.3.1 方法进样。

表3 溶剂/基质混合标准工作曲线中各化合物浓度梯度

（4）基质混合标准工作曲线的制备。称取3 种空白基质样品各2 g（精确至0.01 g），每种平行6 份。同样品溶液的制备方法进行提取和净化，得空白基质溶液，合并于50 mL 塑料离心管，再分别精确移取1 mL 置于5 支10 mL 玻璃试管中，40 ℃水浴中氮气吹干，均加入同位素内标混合对照品工作溶液（5 µg·mL-1）20 µL，再依次加入1 mL 相应质量浓度的混合标准工作液，复溶混匀（见表3），过0.22 μm有机滤膜，按1.3.1 方法进样。

（5）加标回收及精密度测试。称取3 种空白基质样品各2 g（精确至0.01 g），每种平行6 份。设置一个浓度水平加标回收，分别加入20 µL 混合对照品溶液A 和300 µL 同位素内标混合对照品工作溶液（5 µg·mL-1），同样品溶液的制备方法进行提取和净化，按1.3.1 方法进样。

（6）检出限、定量限的确定。利用空白基质添加5 种生物碱目标化合物，以3 倍信噪比对应检测浓度确定方法检出限，以10 倍信噪比对应的检测浓度确定方法定量限。

2 结果与分析

2.1 标准工作曲线线性范围

本实验方法得出的各目标化合物的线性范围如表4 所示，其中罂粟碱、那可丁、蒂巴因线性浓度范围为0.20 ～5.00 ng·mL-1，吗啡、可待因的线性浓度范围为1.00 ～25.00 ng·mL-1，相关系数均在0.998 以上，说明各目标化合物的峰面积与进样浓度在线性范围内呈现良好的相关性。

表4 5 种生物碱的线性范围定量分析

2.2 不同基质的基质效应分析

按公式（1）分析基质效应影响，结果如表5 所示。由表5 可知，用高效QuEChERS 方法处理空白基质，5 种生物碱均表现为基质抑制效应。其中，罂粟碱、那可丁、蒂巴因在外标法定量分析中，3 种基质中的|ME|≤0.22，基本呈现弱的基质效应；吗啡、可待因在外标定量和内标法定量中，3 种基质中的|ME|均在0.2 ～0.5，呈现中等基质效应，同时可以发现内标法定量分析加大了这种效应趋势。

表5 5 种生物碱在3 种基质中的基质效应

式中：ME为基质效应；A为基质标准曲线斜率；B为溶剂标准曲线斜率。当ME＞0，表明基质效应增强；ME＜0，表明基质效应抑制；|ME|=0表示不存在基质效应；|ME|＜0.2 为弱基质效应；0.2 ≤|ME|≤0.5 为中等基质效应；|ME|＞0.5 为强基质效应[6]。

2.3 不同标曲定量分析加标回收率

从表6 可知，用溶剂标曲外标法和基质标曲外标法定量分析罂粟碱、那可丁、蒂巴因在羊汤、火锅汤、水煮鱼汤中的加标回收率情况，回收率均能满足实验室质量控制规范，表明该高效QuEChERS前处理方法对罂粟碱、那可丁、蒂巴因3 种生物碱的提取效率较好。但可以发现基质标曲外标法定量相较于溶剂标曲外标法定量而言，回收率均有所上升，除了罂粟碱和那可丁在水煮鱼汤基质加标中的上升幅度比较大，达到21%和27%，其余上升幅度均不超10%，影响相对有限。其中蒂巴因在火锅汤基质加标中的上升幅度最低，仅有1%左右。这与2.2分析的基质效应抑制相对应，基质效应越弱，两种标曲定量出来的回收率结果越接近，反之相差越大。由此可见，使用基质标曲外标法定量罂粟碱、那可丁、蒂巴因相对准确，但为了方便快捷，减少基质空白前处理过程，参考实验室质量控制规范要求，由于罂粟碱、那可丁和蒂巴因基质效应偏弱，可以采取溶剂标曲外标法定量分析。

表6 不同标曲定量分析3 种基质中5 种生物碱的加标回收率、定量限、检出限

用溶剂标曲外标法和基质标曲外标法定量分析吗啡、可待因在羊汤、火锅汤、水煮鱼汤中的加标回收率情况，基质标曲外标法定量能让回收率上升幅度在25%～55%，但回收率结果均不足50%，未能有效满足实验室质量控制规范。可见，即使吗啡、可待因在3 种基质中的基质效应影响较大，呈现中等基质效应，用基质标曲外标法定量仍未能满足要求。而用溶剂标曲内标法定量分析，吗啡的回收率在82%～85%，可待因的回收率在85%～87%，均能满足实验室质量控制规范。这与吗啡、可待因在高效QuEChERS 前处理过程中损失有着密切联系。据此，笔者提出该前处理方法是影响吗啡、可待因提取效率的第一影响因素，而基质效应为次影响因素。为此，采取了用基质标曲内标法定量分析了加标回收情况，结果是吗啡回收率范围在123%～149%，可待因的回收率范围在140%～149%，这可能是吗啡-D3、可待因-D3 内标物校正了QuEChERS 前处理过程中目标化合物的损失（含基质效应影响的部分）和基质标曲校正了基质效应影响的双重叠加的结果，偏离了实验室质量控制规范范围。由此可以得出，QuEChERS 前处理方法是影响吗啡、可待因提取效率的第一影响因素，基质标曲外标法定量对其改善不足，用溶剂标曲内标法定量分析较为可靠，也相对方便快捷。

2.4 方法学验证的结果分析

按2.3 分析，本文针对罂粟碱、那可丁和蒂巴因选取溶剂标曲外标法定量分析，吗啡、可待因选取溶剂标曲内标法定量分析，确定该方法的方法学参数的可靠性。从表4 可知，罂粟碱、那可丁、蒂巴因线性浓度范围为0.20 ～5.00 ng·mL-1，吗啡、可待因的线性浓度范围为1.00 ～25.00 ng·mL-1，相关系数均在0.998 以上。从表6 可知，5 种生物碱在3 种基质中的定量限和检出限均较低，在羊汤、火锅汤、水煮鱼汤中的定量限位于0.08 ～4.50 μg·kg-1，检出限位于0.02 ～1.35 μg·kg-1。从表7 可知，5 种生物碱在羊汤、火锅汤、水煮鱼汤中加标回收率在69%～88%，RSD 在0.2%～5.5%。由此可见，此方法具有较低的定量限、检出限，在线性范围内各目标化合物的相关性良好，同时具有较好准确度和精密度。

表7 5 种生物碱准确度与精密度结果（n=6）

3 结论

本文对比分析了5 种生物碱在羊汤、火锅汤以及水煮鱼汤基质中的基质效应强弱，同时用溶剂外标法、基质外标法、溶剂内标法、基质内标法4 种不同标准工作曲线定量分析加标样品，指出罂粟碱、那可丁和蒂巴因3 种生物碱在羊汤、火锅汤以及水煮鱼汤基质中的基质效应抑制较弱，溶剂标曲外标法和基质标曲外标法定量结果均能满足实验室质量控制规范；而吗啡和可待因2 种生物碱在羊汤、火锅汤以及水煮鱼汤基质中受到的基质效应抑制为中等强度，考虑高效QuEChERS 前处理是影响吗啡、可待因提取效率的第一影响因素，而基质效应为次影响因素，经过对比分析只有溶剂标曲内标法的定量结果能满足实验室质量控制规范。通过方法学验证，结果表明，可以不考虑不同基质对5 种生物碱的影响，采用溶剂标曲外标法定量分析罂粟碱、那可丁、蒂巴因，采用溶剂标曲内标法定量分析吗啡、可待因，建立一种高效QuEChERS-UPLC-MS/MS 方法，一次性同时检测羊汤、火锅汤和水煮鱼汤3 种餐饮食品中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因5 种生物碱的含量。该方法的灵敏度高，准确度、重复性较好，操作简便、快速，可为市场监管相关餐饮食品中罂粟壳生物碱残留量提供思路。