椰毒假单胞菌酵米面亚种灭活条件研究

苏妙贞，丁清龙，曾晓琮，苏章庭

（广东省食品检验所，广东广州 510435）

椰毒假单胞菌酵米面亚种是中国科学家在东北酵米面中分离出的一种致病菌，与唐菖蒲伯克霍尔德菌亲缘关系最近，故归入唐菖蒲伯克霍尔德氏菌[1]。在适宜的温度下，椰毒假单胞菌酵米面亚种污染食品后产生大量米酵菌酸，米酵菌酸是该菌引起食物中毒的主要原因。2018 年，广东省东莞市出现第一例因食用河粉米酵菌酸中毒，最终致死的事件。2020 年，广东省揭阳市惠来县再次发生河粉米酵菌酸中毒事件；黑龙江省发生了食用酸汤子米酵菌酸中毒的惨剧[2]。近年来，湿米粉被椰毒假单胞菌酵米面亚种污染多次引起米酵菌酸中毒事件，研究湿米粉中该菌的灭活条件变得迫切。

在湿米粉生产过程中，企业常用的杀菌手段有加热杀菌、紫外辐照杀菌，其中加热杀菌用于湿粉蒸煮工艺，紫外辐照杀菌用于车间环境日常清洁消毒。蛋白质是微生物的重要组成成分，蛋白质变性或凝固可使微生物失去活性而死亡，加热能使蛋白质变性。在60 ℃下，蛋白质开始变性，细菌一般在65 ～80 ℃就能被杀死，但一些芽孢菌在环境恶劣时能产生芽孢，100 ℃以上的高温才能使芽孢失活[3]。椰毒假单胞菌酵米面亚种不产生芽孢，从结构上看，该菌不耐高温。因食品基质不宜使用化学灭菌方法，紫外线辐照杀菌是食品企业常用的消毒手段，特定波长范围内的紫外线照射可破坏微生物细胞中的核酸，导致微生物的死亡，以达到消毒杀菌的目的[4]。紫外剂量是影响杀菌效果的直接因素，与照射所用的紫外线灯强度成正比，与物体被照射的时间成正比[5]。本文从加热灭菌和紫外灭菌两方面，研究杀灭椰毒假单胞菌酵米面亚种的物理条件。在液体培养基中培养一段时间后，椰毒假单胞菌酵米面亚种能在液面产生菌膜，菌膜容易覆盖在设备表面上生长，比菌体更具抗性，因此加热灭菌实验分别针对菌体与菌膜进行[6]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株分离自碎米，经VITEK 2 鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌，经产毒实验提取到米酵菌酸的产毒株。GVC 增菌液、马铃薯葡萄糖水（Potato Dextrose Water，PD 水）、马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）、平板计数琼脂（Plate Count Agar，PCA），均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅；SX-700 高压灭菌锅；LRH-250 生化培养箱；AC2-4S1 生物安全柜；紫外灯管（229.1 μW·cm-2、154.1 μW·cm-2、80.0 μW·cm-2）。

1.3 实验方法

1.3.1 加热灭活实验

（1）椰毒假单胞菌酵米面亚种菌体加热灭活实验。取培养3 d 后的椰毒假单胞菌酵米面亚种PDA 平板上菌苔，用生理盐水配制浓度为108CFU·mL-1的菌悬液，按比例稀释为105CFU·mL-1和102CFU·mL-1的菌悬液，3 种菌悬液各配制60 mL，用低、中、高浓度菌液分别代表102CFU·mL-1、105CFU·mL-1、108CFU·mL-1的菌液。准备已灭菌的1.5 mL 离心管，放入1 mL 菌液，封好后置于调好温度的水浴锅中处理一定时间。处理完后取出冷却，将菌液倒入平板中，倒入PDA 琼脂混匀，于36 ℃培养48 h。相同步骤设立空白对照，空白对照无需于水浴锅中加热处理，实验组做2 份平行样。处理温度为60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃，处理时间为10 s、30 s、60 s、90 s、120 s、180 s 和300 s，记录平板生长情况。

（2）菌膜加热灭活实验。椰毒假单胞菌酵米面亚种在生长过程中会产生菌膜，菌膜易在输送米浆的管道内附着滋生。当管道内滋生菌膜后，米浆流过可能会携带椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌膜，本实验研究加热能否将菌膜中的椰毒假单胞菌酵米面亚种杀死。挑取一环椰毒假单胞菌酵米面亚种接种至10 mL 无菌马铃薯葡萄糖水（PD 水）试管中，30 ℃培养6 d 后形成菌膜。用接种针小心挑取菌膜放置于无菌滤膜中央，以经烧灼灭菌后的不锈钢片为承托，放入锅中。用沸腾状态的常压水蒸气分别蒸煮处理0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min 和3.0 min 后，将滤膜贴于平板计数琼脂表面于36 ℃培养，取未经加热处理的菌膜滤膜贴于平板计数琼脂表面培养作为未处理空白参照。

1.3.2 紫外杀灭椰毒假单胞菌酵米面亚种实验

紫外线消毒杀菌法是食品企业常用的消毒方式，本实验探究紫外线强度、照射时间对椰毒假单胞菌酵米面亚种杀灭效果的影响。以108CFU·mL-1的菌液配制107CFU·mL-1、105CFU·mL-1、103CFU·mL-1椰酵假单胞菌酵米面亚种菌液，涂布于PDA 平板后，将PDA 平板分别置于229.1 μW·cm-2（模拟高强度紫外线灯）、154.1 μW·cm-2（模拟中强度紫外线灯）、80.0 μW·cm-2（模拟普通30 W 紫外线灯）紫外线灯管下作用2 min、5 min、10 min、15 min 和30 min，作用结束后放置于36 ℃培养48 h，观看菌落生长结果，每个实验做两个平行。

2 结果与分析

2.1 加热灭活实验结果分析

2.1.1 椰毒假单胞菌酵米面亚种菌体加热灭活结果分析

平板上无菌落生长即为杀灭率达到100%，统计3 种浓度菌液经加热处理后达到100%杀灭率的温度与处理时间，结果见图1。菌液浓度越高，杀灭全部细菌所需的时间越长。随着处理温度的升高，杀灭全部细菌所需的时间大幅缩短。《湿米粉生产和经营卫生规范》（DBS44/ 017—2021）要求蒸煮定型时长需保持1 min 以上，企业的蒸煮隧道湿粉从头到尾蒸煮约1.5 min，使用100 ℃处理1.5 min 的加热方法能有效杀灭椰毒假单胞菌酵米面亚种菌体。

图1 杀灭率为100%时，不同浓度菌液所需处理温度与时间

2.1.2 菌膜加热灭活实验结果分析

由图2 可知，未经热处理的菌膜表面湿润，扩散生长；经热处理过的菌膜表面干燥，无继续生长迹象，表明菌膜已失去活性，这说明菌膜的耐热性不强，经常压下水蒸气处理0.5 min 即可杀灭。

图2 菌膜加热灭活实验结果

2.2 紫外杀灭椰毒假单胞菌酵米面亚种实验结果

由 图3 可 知，在229.1 μW·cm-2紫 外 线 作 用下，15 min 可杀灭103CFU·mL-1浓度的椰毒假单胞菌酵米面亚种，30 min 可杀灭105CFU·mL-1、107CFU·mL-1浓度的椰毒假单胞菌酵米面亚种。

图3 高强度紫外线下杀菌效果

由图4 可知，在154.3 μW·cm-2紫外线作用下，15 min 可杀灭103CFU·mL-1浓度的椰毒假单胞菌酵米面亚种，30 min 可部分杀灭105CFU·mL-1及107CFU·mL-1浓度的椰毒假单胞菌酵米面亚种。

图4 中强度紫外线下杀菌效果

由 图5 可 知，在80.3 μW·cm-2紫 外 线 作 用下，作用30 min 未能杀灭107CFU·mL-1浓度的椰毒假单胞菌酵米面亚种，作用30 min 可杀灭部分105CFU·mL-1浓度的椰毒假单胞菌酵米面亚种，作用15 min 可杀灭103CFU·mL-1浓度的椰毒假单胞菌酵米面亚种，但作用30 min 发现103CFU·mL-1浓度的椰毒假单胞菌酵米面亚种存在部分生长，可能因摆放不当导致杀灭效果有偏差。

图5 低强度紫外线下杀菌效果

3 结论与讨论

湿米粉的生产过程为大米浸泡、自来水清洗、磨浆、调节波美度、加热熟化、定型、鼓风冷却、切刀切割和称重包装[7]，加热熟化为生产过程中的关键步骤。研究表明，椰毒假单胞菌酵米面亚种主要来源于生产原料中的米，在加工过程中能污染到米浆和输送管路[8]。熟化步骤为产品从生到熟的加工步骤，该过程通过加热杀死椰毒假单胞菌酵米面亚种。本次实验表明，根据广东省卫生健康委员会发布的《食品安全地方标准 湿米粉生产和经营卫生规范》（DBS 44/017—2021）中8.2“应制定蒸煮定型间（区）岗位操作规程，对蒸煮定型设备的压力或温度等关键条件进行监控，确保加热温度≥100 ℃、加热时间保持1 min 以上，或采用其他等效杀菌效果的热加工工艺，并做好记录”的要求[9]，生产企业可以用加热方式杀死米浆中存在的菌或菌膜。湿米粉生产企业一般使用紫外灯进行表面消毒，实验表明紫外线能杀死一定浓度的菌，但受照射距离、照射物品厚度的影响，消毒效率有一定损失。因此，企业应以加热杀菌为主，紫外照射为辅的手段杀灭湿米粉中的椰毒假单胞菌酵米面亚种。