高效液相色谱法同时测定糕点中的苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸

黄 程，叶小萱，董红兵

（武汉商学院 食品科技学院，湖北武汉 430056）

糕点是人们生活中的一款常见食品，主要以谷类、薯类、豆类、油脂、糖和蛋等中的一种或多种为原料，按需添加其他辅料，经过调制、成型、熟制等工艺制作而成，深受消费者喜爱[1]。在糕点的制作过程中，为了延长其货架期，人们可能会添加食品防腐剂，以增加糕点的商业价值[2]。目前，苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸等防腐剂的使用在食品中屡见不鲜[3]。防腐剂主要是通过抑制食品中微生物的生长与繁殖达到防腐效果。苯甲酸是人们使用较早的一类酸性食品防腐剂，使用历史较长，过量摄入会影响人体血压、心脏、肾脏功能。研究表明，对大鼠肝肾多次给药苯甲酸钠，对肝脏造成了一定的损害[4-8]。山梨酸是很多国家的首选防腐剂，具有超高的安全性，但是过量摄入会对人体产生不良影响[9]。脱氢乙酸是一种广谱高效的食品防腐剂，受到各类食品企业的普遍欢迎，被广泛应用于奶油、面包、蛋糕等糕点中[10-11]。

目前，对苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸检测方法的研究很多，但以乙醇-水溶液作为提取溶剂，结合液相色谱测定的方法研究较少[12-15]。苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的检测主要采用《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）[16]和《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）[17]中规定的方法。检测一份样品中不同防腐剂的含量需分开检测，增加了工作量，加大了工作难度，降低了检测效率，且成本普遍较高，因此建立一种可以同时检测多种防腐剂的方法具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糕点样品购买于本地超市。苯甲酸（99.66%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司）；山梨酸（99.18%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司）；脱氢乙酸（上海安普实验科技股份有限公司）；甲醇（色谱级，德国merck 公司）；乙酸铵（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇、乙酸锌、亚铁氰化钾、硫酸锌和氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

1.2 仪器与设备

Waters2695 高效液相色谱仪，美国Waters 公司；TGL-205 离心机，湖南平凡科技有限公司；KQ-250B 型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；电子分析天平，上海越平科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

称取苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸标准物质各20 mg 于10 mL 容量瓶中，加入少量无水乙醇溶解后，定容至10 mL 刻度线处，配制成浓度为2 000 μg·mL-1的标准储备溶液。分别移取苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸标准储备溶液1 mL 于10 mL 容量瓶中，以无水乙醇定容，配制成浓度为200 μg·mL-1的混合标准溶液。

1.3.2 样品前处理

准确称取2 g 粉碎均匀的样品放入离心管中，加入20 mL 提取溶剂，涡旋混匀，50 ℃超声提取20 min，冷却至室温，10 000 r·min-1离心10 min，上清液经0.45 μm 微孔滤膜过滤，备用。

1.3.3 色谱条件

色 谱 柱：Acclaim 120A C18色 谱 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30.0 ℃；流动相：甲醇+20 mmol·L-1乙酸铵溶液=13 ∶87（V∶V）；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：230 nm。

1.3.4 提取溶液的选择

准确称取空白样品2 g 于50 mL 离心管中，分别添加10 μg、20 μg、40 μ（gn=3）的混合标准溶液，振荡混匀，加入20 mL 乙醇-水溶液（乙醇浓度为0%、20%、40%、50%、60%和80%，V∶V），涡旋混匀，50 ℃超声提取20 min，冷却至室温，10 000 r·min-1离心10 min，0.45 μm 微孔滤膜过滤上清液，得待测液。高效液相色谱测定待测液中的防腐剂，计算3 种防腐剂的回收率。

1.3.5 方法验证

①测定线性范围及检出限。将苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸混合标准溶液配制成0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、25.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1的系列标准溶液，按1.3.3色谱条件进样分析，以3 种防腐剂的质量浓度为横坐标，峰面积大小为纵坐标，绘制标准曲线。②加标回收试验。取空白糕点样品18 份，每份约2 g，分别添加10 μg、20 μg、40 μg（n=3）的混合标准溶液，加入20 mL 1.3.4 确定的提取溶液，按1.3.2 样品前处理方法处理样品，进行加标回收试验，计算各组分的回收率和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。③精密度试验。质量浓度为1.0 μg·mL-1的混合标准溶液连续重复进样6 次。

2 结果与分析

2.1 提取溶液的选择结果

由图1 知，3 个添加水平下，当提取溶液中乙醇浓度逐渐升高时，苯甲酸和山梨酸的回收率均较高且相差不大；在100%乙醇作为萃取溶剂时，回收率下降明显。脱氢乙酸在乙醇含量高于50%时，回收率开始下降，随提取液中乙醇浓度的提高不断下降，尤其是在10 μg 加标浓度下。且当提取液中乙醇含量超过60%时，脱氢乙酸的色谱峰由尖峰变为驼峰，本方法提取溶剂中乙醇比例对脱氢乙酸影响较大。综合考虑，选择40%乙醇溶液，即40%的乙醇-水溶液作为提取溶剂。

图1 不同比例乙醇-水溶液对3 种防腐剂的提取回收率

2.2 方法验证结果

2.2.1 线性范围及检出限

苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸在0.20 ～50.33 μg·mL-1线性良好，相关系数＞0.999。以S/N=3 计算检出限，以S/N=10 计算定量限，当取样量为2 g 时，苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的最低检出限为0.161 mg·kg-1、0.160 mg·kg-1、0.160 mg·kg-1，定量限为0.403 mg·kg-1、0.400 mg·kg-1、0.399 mg·kg-1，详细结果见表1。

表1 苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的线性范围、检出限、定量限

2.2.2 加标回收试验结果

从表2 可看出，3 种防腐剂的平均回收率为93.16%～99.74%，相对标准偏差为0.50%～4.00%，表明方法回收率和重现性良好，结果准确可靠，误差在可接受范围之内。混合标准溶液色谱图和空白样品加标色谱图如图2 所示，3 种防腐剂出峰顺序为苯甲酸、脱氢乙酸、山梨酸，保留时间在7.3 min、8.9 min、9.7 min 左右，3 种防腐剂色谱峰峰形良好，峰形尖锐对称，可完全分离，且样品中杂质对色谱峰无干扰。

表2 苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸回收率和相对标准偏差（n=6）

图2 混合标准溶液及空白样品加标色谱图

2.2.3 精密度试验

由表3 可知，苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的RSD 为0.51%、0.21%和0.59%，具有良好的精密度。

表3 苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸精密度

2.3 样品的测定结果

用建立的方法测定市场销售的5 批次糕点中3种防腐剂的含量，并与国家标准方法进行对比，结果见表4。本实验方法所测定的实际样品中的防腐剂含量与国标方法测定样品中防腐剂含量基本相符，本实验方法的结果可靠，适用于糕点中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸3 种常用防腐剂的同时检测。

表4 本方法与国家标准方法测定样品结果对比

3 结论

本研究选取乙醇-水溶液作为提取溶剂，利用高效液相色谱法建立了一种检测糕点中多种食品防腐剂的方法，考察了该方法的线性范围、检出限、定量限、加标回收率和精密度等，将检测结果与国家标准方法进行比较，结果表明该方法具有快速、简便、高效的优点，是一种简便、快捷、准确的检测方法，可以为糕点中多种防腐剂的测定提供依据。

注：—代表未检出。