一起副溶血性弧菌食源性聚集事件的实验室检测及病原分析

李佳琪，罗昱玥，章兴隆，刘义萍，周莹冰

（重庆市渝中区疾病预防控制中心，重庆 400010）

副溶血性弧菌是一类革兰氏阴性无芽孢杆菌，具有嗜盐性，可引起人类多种不同疾病，如败血症、急性胃肠炎、伤口感染等[1]。副溶血性弧菌最早于1950 年从日本1 例食物中毒的病人粪便中初次分离得到，是最常见的食源性致病菌之一，在近海岸的海水、海产品、海底沉积物中广泛存在。由于海产品在运输和销售中会交叉污染，导致副溶血性弧菌在淡水产品中也被大量检出。人们摄入被副溶血性弧菌污染的食品会引发食物中毒，导致患者出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻和发烧等典型急性胃肠炎反应。副溶血性弧菌是细菌性食物中毒事件中的重要病原体。2021 年4 月18 日，渝中区疾病预防控制中心接到某医院电话报告称“某游轮出现10 余名疑似食物中毒病人”，立即赶往医院与游轮现场进行流行病学调查，采集肛拭子，留样食品进行检测。根据患者的临床表现、流行病学调查结果、实验室检测结果综合研判，认为本次事件是一起由副溶血性弧菌引起的食源性聚集事件。为进一步了解阳性菌株的病原学特征以及各菌株之间的相关性，本研究对分离的副溶血弧菌进行血清学鉴定、实时荧光PCR 鉴定毒力基因、脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）分子分型和药敏试验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

显色培养基，科玛嘉微生物技术有限公司；其余培养基，北京陆桥技术股份有限公司；副溶血性弧菌血清，日本生研公司；病毒核酸提取试剂盒（磁珠法），江苏硕世生物科技有限公司；诺如病毒G Ⅰ/G Ⅱ双重荧光PCR 检测试剂盒、食源性致病菌核酸多重实时荧光PCR 检测试剂盒、副溶血性弧菌（tdh、trh、tlh）三重核酸检测试剂盒，北京卓诚惠生生物科技有限公司；VITEK 2 Compact GN 鉴定卡，法国生物梅里埃股份有限公司；限制性内切酶Xba Ⅰ、Not Ⅰ，日本TaKaRa 生物工程有限公司；琼脂糖SeaKem Gold Agarose，瑞士LONZA；蛋白酶K，北京索莱宝科技有限公司；革兰阴性菌药敏检测卡（CHNENF)，赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 设备与仪器

SSNP-9600A 全自动核酸提取仪，江苏硕世生物科技有限公司；VITEK 2 Compact 全自动微生物生化鉴定仪，法国生物梅里埃股份有限公司；CFX96实时荧光定量PCR 仪，美国Bio-Rad 公司；CHEF Mapper 脉冲场凝胶电泳仪及凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品来源

采集样品28 件，其中病例肛拭标本13 件，留样食品15 份，病例肛拭标本一式两份，分别存放于Cary-Blair 运送培养基和病毒采样液中，及时送至实验室检测。

1.3.2 病原菌的分离鉴定

对采集样品进行诺如病毒和食源性致病菌实时荧光PCR 检测，按照国家标准对沙门氏菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌和致泻性大肠埃希氏菌等病原菌进行增菌分离培养。

1.3.3 血清学试验

取新鲜分离培养的副溶血性弧菌菌苔至含3%氯化钠的5%甘油溶液中，研磨乳化均匀，121 ℃高压1 h，4 000 r·min-1离心15 min，吸取上清液，加入等体积的生理盐水重悬，玻片凝集检测O 抗原，生理盐水作为自凝对照。取菌苔与含3%氯化钠的5%甘油溶液制备浓厚的菌悬液，玻片凝集检测K 抗原，3%氯化钠溶液作为自凝对照。

1.3.4 毒力基因鉴定

用接种环刮取新鲜培养的菌苔于100 μL DNA裂解液中研磨均匀，100 ℃水浴10 min 后冰上放置5 min，12 000 r·min-1离心2 min，取上清液进行实时荧光PCR 检测毒力基因（tdh、trh、tlh）。

1.3.5 脉冲场凝胶电泳分型

分离出的5 株副溶血性弧菌以Not Ⅰ酶切，沙门菌标准菌株H9812 用限制性内切酶Xba Ⅰ酶切，作为分子量标（marker），电泳时间18 h，脉冲时间10 ～35 s，以Gelred 染胶后使用凝胶成像系统成像。

1.3.6 药敏试验

按照微量肉汤稀释法对分离的病原菌进行药敏试验，采用定制的商品化MIC 药敏板CHNENF 进行药敏测试，含氨苄西林、头孢西丁、美罗培南、环丙沙星、氯霉素等17 种抗菌药物，大肠埃希氏菌标准菌株ATCC 25922 作为本次试验的质量控制菌株。

2 结果与分析

2.1 病原体检测

经实时荧光PCR 检测，所有样品诺如病毒检测均为阴性；食源性致病菌核酸多重实时荧光PCR 检测出5 件病例肛拭样品弧菌阳性，其余样品均为阴性。28 件样品进行分离培养，荧光PCR 检测为弧菌阳性的5 件样品均分离到副溶血性弧菌，未检出其他致病菌，其余8 件肛拭样品和15 件留样食品均未检出致病菌。

2.2 血清学试验

分离到的5 株副溶血性弧菌均为O9:K44 血清型，结果一致。

2.3 毒力基因鉴定

对分离到的5 株副溶血性弧菌采用实时荧光PCR 方法检测毒力基因，5 株副溶血性弧菌均为tdh、tlh 基因阳性，trh 基因阴性，结果一致。

2.4 PFGE 分子分型

用限制性内切酶Not Ⅰ对5 株副溶血性弧菌基因组核酸酶切，进行脉冲场凝胶电泳，结果如图1 所示，YZFX2021-004、YZFX2021-005、YZFX2021-007 具有完全相同的带型，另外2 株稍有不同。如图2 所示，PFGE 分子分型聚类分析发现YZFX2021-004、YZFX2021-005、YZFX2021-007 的同源性为100%，YZFX2021-006 和YZFX2021-003 与 这3 株的同源性为88.89%、83.78%。

图1 5 株副溶血性弧菌PFGE 图像

图2 5 株副溶血性弧菌PFGE 聚类分析图谱

2.5 药敏试验结果

本次试验质控标准菌株ATCC 25922 药敏结果在质控范围内，表明试验结果有效。结果判定参照《疾控系统药敏判断标准-2022 修订》，药敏结果显示5 株菌株对氨苄西林中度敏感，对氯霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、多粘菌素 E、厄他培南、美罗培南、头孢噻肟、头孢他啶、头孢他啶/阿维巴坦、四环素、替加环素、头孢西丁、环丙沙星、萘啶酸、阿奇霉素、阿米卡星、链霉素均敏感，无多重耐药表型，5 株菌株结果一致。

3 结论与讨论

副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在沿海地区时有发生，在微生物性食物中毒事件中高居首位，发生频次、人群暴露规模均表现出明显的上升趋势。海产品是副溶血性弧菌食源性污染的主要媒介。随着交通运输业的发展和内陆居民饮食结构的变化，我国微生物性食物中毒的致病因子逐步发生了变化。研究表明，在全国范围内，副溶血性弧菌导致的食物中毒事件数量已升至第二位，仅次于沙门氏菌[2]。实验室在5 名病例肛拭子中检出血清型一致的副溶血性弧菌O9:K44 型，虽然未在留样食物中检出该菌，同时由于游轮方食品留样不全，不排除游客食用了游船之外的食品，可能存在携带致病菌食物漏检的情况。尽管未确定病因食品，但根据现场流行病学调查、患者的临床表现、实验室检测结果综合分析，判定该事件为一起由副溶血性弧菌引起的聚集性、食源性疾病事件。

实验室通过荧光PCR 快速筛查和常规分离培养鉴定，迅速获得了副溶血性弧菌核酸阳性结果，这一结论在后续的分离培养中得到证实，对于事件的及时处理和控制起到了关键作用。在突发性食源性疾病事件调查中，应用快速检测方法对于及时确定病原体、开展后续事件处置工作具有重要的意义。

副溶血性弧菌的致病性主要由毒力因子造成，毒力因子包括溶血素类、侵袭因子、尿素酶等。溶血素类包括耐热直接溶血素（Thermostable Direct Hemolysin，TDH）和耐热相关溶血素（Tdh-elated Hemolysin，TRH），二者作用于宿主细胞表面，可破坏细胞的完整性[3]。副溶血性弧菌还可产生不耐热溶血素（Thermolabile Hemolysin，TLH），现普遍认为tlh 基因是副溶血性弧菌的特异性基因，在所有分离株中均可检测到。本实验室对分离培养出来的5株副溶血性弧菌进行tdh、trh、tlh 基因检测，发现5株菌株均为tdh 和tlh 基因阳性，trh 基因阴性。

PFGE 是目前广泛应用于食源性致病菌分子溯源的重要方法[4-5]。根据公认的判定标准[6]，具有85%以上相同条带的菌株可认为是相同菌株。在本次事件中，分离到的5 株副溶血性弧菌有4 株菌株经PFGE聚类分析发现具有85%以上的相似性，另一菌株带型与这4 株稍有不同，提示本次事件中可能存在不同的污染源，但未从食品中分离出相关菌株，不能判断本次事件的病因食品。

分离的5 株菌株对氨苄西林为中度敏感，对头孢他啶、头孢噻肟等其他16 种药物均敏感，与重庆市万州区报道[7]的药敏结果相同，与广州市、浙江省等地报道[8-12]的分离菌株对氨苄西林耐药情况不同，与北京市、辽宁省等地[13-14]副溶血性弧菌的耐药情况有显著不同，表明耐药性除了受血清型、来源背景的影响，还具有地域差异。水产品养殖应规范、合理使用抗生素，避免副溶血性弧菌的耐药性变异，降低多重耐药的风险。对腹泻病人进行抗生素治疗时，应结合药敏试验结果，确保临床合理用药，降低耐药菌株的产生。

游轮旅游具有旅程时间较长、人员聚集程度较高等特点，相关部门应加强对旅行机构餐饮宴席等重点领域的日常监管，强化食品安全知识的宣传培训，提高食品相关从业人员的食品安全意识和个人卫生意识，规范食品制作流程，注意生熟分开，并按要求做好食品的留样，减少食源性疾病的发生。