普鲁卡因通过调控miR-138抑制OGD诱导的大鼠皮层神经元损伤*

张素冰 高辉 赵滨滨 张丹琦

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院麻醉手术科,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第三医院麻醉手术科,黑龙江 哈尔滨 150000)

缺血性脑卒中是常见的脑血管疾病,具有较高的致残率和致死率[1]。脑缺血诱导大脑神经元损伤,主要表现为神经元活性降低及凋亡增加[2]。因此,抑制脑缺血引起的大脑神经元损伤可减缓及治疗脑损伤。普鲁卡因(Procaine,PROC)是临床常用的局部麻醉剂,近年来研究显示PROC可能在肿瘤[3]、心肌损伤[4-5]等疾病中发挥镇痛外效用。同时,PROC还具有钠通道阻滞作用,可抑制细胞膜缺血去极化,从而保护脑缺血[6],然而其具体保护机制还未知。微小RNA(miRNA)是小分子非编码RNA,研究[7]显示,miR-138在氧糖剥夺(Oxgen-glucose deprivation,OGD)诱导的大鼠皮层神经细胞中表达下调,上调miR-138可减轻神经细胞损伤,其表达异常可能参与缺血性脑卒中发病。鉴于此,本研究将从miR-138角度,探究普鲁卡因对OGD诱导大鼠皮层神经元损伤的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 大鼠皮层神经元细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司;PROC购自常州市卓燊医药化工材料有限公司;DMEM培养液、Annexin V-FITC/PI试剂盒、LipofectamineTM 2000试剂盒和CCK-8试剂盒购自北京索莱宝公司;乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)试剂盒购自南京建成公司;胎牛血清购自浙江天杭公司;活化的半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)、cleaved-caspase9抗体、pro-caspase3抗体、pro-caspase 9抗体购自美国Abcam公司;PCR实验相关试剂盒购自大连宝生物工程公司;引物序列、miR-138模拟物(mimics)及抑制剂(anti-miR-138)、模拟对照序列(miR-NC)及抑制剂阴性序列(anti-miR-NC)由上海生工生物工程公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染与分组 用含10%胎牛血清的DMEM培养液悬浮大鼠皮层神经元细胞,置于CO2培养箱中培养。参照文献[8]方法建立OGD模型:以无糖DMEM培养液悬浮细胞,置于5% CO2、95% N2、37 ℃条件下培养90 min;加含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养12 h。将细胞以1.0×105个/孔接种至96孔板,置于CO2培养箱中培养4 h,分别用含0.00、3.50、7.00、14.00 mg/L[3]PROC的培养液培养24 h,建立OGD模型,作为OGD组、OGD+PROC-L组、OGD+PROC-M组和OGD+PROC-H组,同时设置对照(Con)组,常规培养,用于观察PROC对OGD细胞模型的影响;将细胞以1.0×106个/孔接种至6孔板中,置于CO2培养箱中培养24 h,利用LipofectamineTM 2000试剂盒分别转染miR-138 mimics、miR-NC、anti-miR-138、anti-miR-NC,转染12 h,并采用qRT-PCR法检测miR-138表达,验证转染效果,再建立OGD模型,其中转染anti-miR-138、anti-miR-NC的细胞用含有14.00 mg/LPROC的培养液培养24 h,分别作为OGD+miR-138组、OGD+miR-NC组、OGD+PROC+anti-miR-138组、OGD+PROC+anti-miR-NC组,用于探究PROC对OGD细胞模型的潜在机制。

1.2.2 CCK-8法检测神经元存活率 各组培养结束,添加10 μL/孔CCK-8试剂,继续孵育2 h,再置于酶标仪中,设置波长450 nm,测定各孔吸光度(Absorbance,A)值,计算存活率(%)=A值实验组/A值对照组×100%。

1.2.3 LDH漏出率检测 收集各组处理后培养上清液,4500 r/min离心10 min,离心半径为10 cm,取上清液,严格按照LDH试剂盒说明书,检测LDH含量,计算各组LDH释放率。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组处理后细胞,利用Annexin V-FITC/PI试剂盒,上流式细胞仪检测凋亡细胞数。

1.2.5 蛋白质印迹法检测cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白 收集各组处理后细胞,用RIPA试剂提取总蛋白,BCA法检测蛋白浓度,用SDS-PAGE分离总蛋白,转至PVDF膜,用5 %脱脂牛奶封闭2 h,于4 ℃用cleaved-caspase3(1∶500)、cleaved-caspase9(1∶500)、pro-caspase3(1∶500)、pro-caspase 9(1∶500)和GAPDH(1∶1000)一抗孵育过夜,室温用山羊抗兔二抗孵育1 h,加显影液显影,曝光拍照,Image软件分析条带灰度值,目的蛋白相对表达量以目的蛋白与内参灰度值的比值表示。

1.2.6 qRT-PCR检测miR-138表达 收集各组处理后细胞,按照1.2.1分组处理后收集细胞,用miRNA提取试剂盒提取总RNA,逆转录为cDNA后,进行PCR扩增。引物序列:miR-138上游5′-GGTGTC CGTGGAGTCGGCAA-3′,下游5′-AACTTCACAA CACCAGCTTA-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCA GCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3′。2-△△Ct法计算miR-138相对U6的表达量。

2 结果

2.1 PROC对OGD诱导大鼠皮层神经元存活率和LDH释放的影响 OGD组存活率低于对照组(P<0.05),LDH释放率高于对照组(P<0.05)。OGD+PROC-L组、OGD+PROC-M组和OGD+PROC-H组存活率均高于OGD组(P<0.05),LDH释放率均低于OGD组(P<0.05)。见表1。

表1 PROC对OGD诱导大鼠皮层神经元存活率和LDH释放的影响Table 1 Effects of PROC on the survival rate and LDH release of OGD-induced rat cortical neurons

2.2 PROC对OGD诱导大鼠皮层神经元凋亡的影响 OGD组凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达均高于对照组,pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白表达均低于对照组(P<0.05)。OGD+PROC-L组、OGD+PROC-M组和OGD+PROC-H组凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达均低于OGD组,pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白表达均高于OGD组(P<0.05)。见图1、表2。

图1 PROC对OGD诱导大鼠皮层神经元凋亡的影响Figure 1 Effects of PROC on OGD-induced apoptosis of cortical neurons in rats注:A.凋亡相关蛋白表达; B.流式细胞术检测细胞凋亡。

表2 PROC对OGD诱导大鼠皮层神经元凋亡的影响Table 2 Effects of PROC on OGD-induced apoptosis of cortical neurons in rats

2.3 PROC对OGD诱导大鼠皮层神经元中miR-138表达的影响 对照组、OGD组、OGD+PROC-L组、OGD+PROC-M组和OGD+PROC-H组miR-138表达量分别为(1.00±0.00)、(0.28±0.03)、(0.43±0.04)、(0.69±0.05)和(0.86±0.06)。OGD组miR-138表达低于对照组(P<0.05)。OGD+PROC-L组、OGD+PROC-M组和OGD+PROC-H组miR-138表达均高于OGD组(P<0.05)。

2.4 过表达miR-138对OGD诱导大鼠皮层神经元损伤的影响 OGD+miR-138组miR-138表达量高于OGD+miR-NC组[(2.94±0.27)vs(1.00±0.00)](P<0.05)。OGD+miR-138组存活率高于OGD+miR-NC组(P<0.05),LDH释放率、凋亡率及cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达均低于OGD+miR-NC组,pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白表达均高于OGD+miR-NC组(P<0.05)。见图2、表3。

图2 过表达miR-138对OGD诱导大鼠皮层神经元凋亡的影响Figure 2 Effect of overexpression of miR-138 on OGD-induced apoptosis of rat cortical neurons注:A.凋亡相关蛋白表达; B.流式细胞术检测细胞凋亡。

表3 过表达miR-138对OGD诱导大鼠皮层神经元损伤的影响Table 3 Effects of overexpression of miR-138 on OGD-induced rat cortical neurons damage

2.5 敲减miR-138逆转PROC对OGD诱导大鼠皮层神经元损伤的作用 OGD+PROC+anti-miR-138组miR-138表达量低于OGD+PROC+anti-miR-NC组[(0.33±0.03)vs(1.00±0.00)](P<0.05)。OGD+PROC+anti-miR-138组存活率低于OGD+PROC+anti-miR-NC组(P<0.05),LDH释放率、凋亡率及cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达均高于OGD+PROC+anti-miR-NC组,pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白表达均低于OGD+PROC+anti-miR-NC组(P<0.05)。见图3、表4。

图3 敲减miR-138逆转PROC对OGD诱导大鼠皮层神经元凋亡的作用Figure 3 Knocking down miR-138 reverses the effect of PROC on OGD-induced cortical neuron apoptosis in rats注:A.凋亡相关蛋白表达;B.细胞凋亡流式图。

表4 敲减miR-138逆转PROC对OGD诱导大鼠皮层神经元损伤的作用Table 4 Knocking down miR-138 reverses the effect of PROC on OGD-induced cortical neuron injury in rats

3 讨论

缺血性脑卒中是常见的脑血管疾病,缺血状态下,神经元活性降低,凋亡增加,导致神经功能受损[9-10]。OGD诱导的神经元损伤模型是常见的缺血神经损伤体外模型[11]。LDH是广泛分布于机体组织中的胞内酶,细胞受损时被大量释放[12-13]。本实验显示,大鼠皮层神经元经OGD诱导后,神经元存活率降低,凋亡率和LDH释放量明显增加,说明OGD模型建立成功。同时,PROC可提高OGD诱导大鼠皮层神经元存活率,降低凋亡率、LDH漏出率,说明其对OGD诱导大鼠皮层神经元损伤具有保护作用。Caspase级联反应参与细胞凋亡,其中caspase9是该级联反应的起始因子,其在活化后生成cleaved-caspase9,传递凋亡信号;caspase3是Caspase级联反应的核心分子,其被活化后生成cleaved-caspase3,进而剪切细胞内各种底物,诱导细胞凋亡[14-15]。本研究表明,PROC可降低OGD诱导大鼠皮层神经元中cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白的表达,增加pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白表达,这提示PROC可能通过抑制Caspase级联反应,阻碍OGD诱导的大鼠皮层神经元凋亡。

miR-138可参与调控细胞凋亡、炎症及免疫等多种生理病理过程,其异常表达与多种疾病的发生发展相关[16-18]。miR-138在缺血性脑卒中内表达降低,上调miR-138可减轻OGD诱导的星形胶质细胞损伤[19-20]。表明miR-138有望成为缺血性脑卒潜在标记物。本实验显示,miR-138在OGD诱导大鼠皮层神经元中表达下调,过表达miR-138后,OGD组细胞增殖活性增加,LDH释放量和细胞凋亡减少,这与李敏等[7]报道结果一致,提示miR-138可保护大鼠皮层神经元免受OGD损伤。本研究还显示,普鲁卡因可促进OGD诱导大鼠皮层神经元中miR-138表达,而恢复实验显示,敲减miR-138可部分逆转普鲁卡因对OGD诱导神经元损伤的作用,这提示普鲁卡因在OGD诱导大鼠皮层神经元损伤中的保护作用,可能通过上调miR-138实现。

4 结论

普鲁卡因可抑制OGD诱导的大鼠皮层神经元损伤,其作用机制可能与上调miR-138有关,但其具体作用机制仍有待进一步探究,未来将从miR-138靶基因及下游信号通路深入分析。