基于活性成分筛选及近红外快检技术的车前草含量研究

刘晓凤 杨放 梁洪 熊毅 梁晴 袁宁谣 叶萌

文章编号：1004－5422（2023）02－0113－06

DOI：10.3969/j.issn.1004-5422.2023.02.001

收稿日期：2022-03-08

基金项目：新药中试四川省重点实验室开放课题（XYZS2022-22）；四川省中医药文化传承与研究中心2021年度科研项目（2021Y012）；德阳市科技局计划资助2022年度科研项目（2022SZ068）；广西壮瑶药重点实验室 2020 年开放课题（GXZYKF2020-04） ；四川省科技成果转移转化示范项目（2023ZHCG0071）

作者简介：刘晓凤（1987—），女，硕士，讲师，从事中药活性成分的提取研究.E-mail：11739589@qq.com

摘要：利用网络药理学筛选车前草的有效活性成分，采取高效液相色谱法建立指标性成分大车前苷含量测定的方法，将含量作为参比，借助偏最小二乘回归算法建立车前草大车前苷的定量校正模型，并对未知样品中大车前苷含量进行预测.结果显示，网络药理学筛选出排名靠前的活性成分有木犀草素、黄芩素、大车前苷、羟基木犀草素和高车前素.近红外检测的大车前苷定标标准偏差、相对分析误差、交叉检验标准误差、校正模型的决定系数、交叉验证相对分析误差和相关系数分别为0.043、7.030、0.265、0.600、1.140和0.993.本研究建立的模型检测速度快、效率高、结果可靠，可用于车前草大车前苷的质量控制.

关键词：车前草；网络药理学；含量测定；近红外快检技术；定量模型

中图分类号：R284.1

文献标志码：A0引言车前草为车前科植物车前（Plantago asiatica L.）或平车前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草，具有利尿通淋、抗菌抗炎、凉血解毒及清热明目的功效［1］ .《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版［2］规定车前草的指标性成分为大车前苷，但其是否是车前草的有效成分还需要进一步研究.

网络药理学是从系统生物学的角度阐述中药成分与疾病靶点之间关系的学科，其可阐明中药的有效活性成分及治疗疾病的作用机制，广泛用于多种疾病、药理及毒理的机制研究，对临床合理用药、发展创新药物及发现新的适应证等可提供数据支撑.中药具有多成分、多靶标和多通路的特点，其并不是通过单一成分预防或治疗疾病，而是通过多成分共同调节发挥作用［3-6］.故采用网络药理学对车前草进行有效活性成分筛选可进一步为研究车前草的有效活性成分、质量控制指标及药理作用机制提供理论依据.车前草作为常用中药［7-9］，其应用广泛.市场上的清宁丸、止泻灵片、复方枇杷叶膏和广东神曲等中成药处方中均含有车前草.由于市场需求较大，药材流通市场上个别原料供应商常通过掺伪或以次充好，导致药品质量参差不齐，故对车前草进行快速检测具有重要意义.

近红外光谱（NIR）法是光谱衡量技术法和化学计量学技术法有效结合的二级分析法，已广泛应用于中草药及其产品分析中［10-13］，相较传统分析方法而言，其具有快速、高效和无污染等优点［10］ .相关研究人员利用NIR技术对川贝母及其掺伪品进行了快速鉴别及掺伪量快速检测［14-15］，建立了三七的质量快速评价体系等［16］.本研究以网络药理学技术为手段，《中国药典》2020 年版为基准，采用NIR法对车前草制定快速检测的方法，高效完成车前草质量分级，增加栽培、采收、加工与销售等各环节的质量把控，以期为车前草质量控制提供参考.

1材料

1.1仪器

NIR Magic 3500型近红外光谱分析仪（北京伟创英图科技有限公司），DHS16-A型快速水分测定仪（上海精科实业有限公司），PCDX-J-10型超纯水仪（成都品成科技有限公司），ESJ182-4型电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司），PS-40型超声波清洗器（深圳得康洗净电器有限公司），LC-2010AAT型高效液相色谱仪（日本岛津公司），FW-80型万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）.

1.2材料

大车前苷对照品（批号，20190122），成都科隆化学品有限公司；51批车前草原药材（批号，CQC20201201～CQC20201251），均采自四川省德阳市，经成都大学郭晓恒副教授鉴定为车前科植物车前（Plantago asiatica L.）的干燥全草；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯.

2方法与结果

2.1网络药理学法

2.1.1“成分—靶点—通路”网络的构建

采用中药系统药理学网络数据库和分析软件、中药分子机制生物信息学分析工具，以及中国天然产物化学成分数据库，检索获得车前草有效活性成分中“化合物—靶点—通路”相互作用PPI网络，得到 47个节点（5 个化合物节点与42 个靶点节点）及274个基因对应通路.该网络中，每个化合物平均与8.40个靶点相互作用，每个靶点平均与6.52个疾病通路有关.因此，车前草中存在單化合物与多靶点的作用，同时也存在多化合物作用于单靶点的现象.

2.1.2GO功能富集分析

通过网络数据库进行GO功能富集分析研究，共得到60个GO条目（P＜0.05），分别对应生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）各20个条目，如图1所示.2.1.3KEGG通路富集分析

同时利用网络数据库进行KEGG通路富集分析，共获得前列腺癌、小细胞肺癌、膀胱癌与非小细胞肺癌等274条信号通路（P＜0.05）.其中，前列腺癌通路涉及RB1、HSP90AA1、CDKN1B、EGFR、PIK3CG、RELA、IGF1R、CASP9、NFKBIA、AR和TP53等基因；膀胱癌通路涉及CCND1、MMP1、CDK4、MMP2、ERBB2、MDM2、MAPK1、TP53、MMP9和EGFR等基因；小细胞肺癌通路涉及NFKBIA、CASP9、CDKN1B、CDK4、AKT1、PTGS2、TP53、RELA、PIK3CG和BCL2L1等基因；非小细胞肺癌涉及RB1、CASP9、CCND1、CDK4、ERBB2、MAPK1和EGFR等基因.选P值较小的前20个通路进行可视化，结果如图2所示.

2.1.4有效成分筛选通过分析“化合物—靶点”的中心度值、亲中心度值及等级值等，筛选出排名前5位的化合物依次为木犀草素、黄芩素、大车前苷、羟基木犀草素和高车前素，分别能与42、9、3、3和2个靶点蛋白发生作用.从靶点的角度分析，排名前5的靶点为AHT1、MAPK1、PIK3CG、TP53和CCND1，分别能与19、17、16、15和15个疾病通路作用［5］.上述网络药理学筛选结果表明，中药是多成分与多靶点共同发挥作用的，而有效成分的含量直接影响中药的质量.通过网络药理学研究可以从整体上对车前草成分进行理论筛选，为后续含量研究提供参考.网络药理学研究结果验证了《中国药典》2020年版规定车前草的指标性成分为大车前苷具有合理性，可通过对车前草中大车前苷的含量对其质量进行控制.

2.2NIR法

采用高效液相色谱（HPLC）法建立车前草中的指标性成分大车前苷含量测定的方法，将含量作为参比，借助偏最小二乘回归算法建立车前草中大车前苷的定量校正模型，并对未知样品中大车前苷含量进行预测.

2.2.1HPLC色谱条件

色谱柱为Supersil ODS2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%甲酸溶液（17∶83）为流动相；检测波长为330 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为10 μL.理论板数按大车前苷峰计算应不低于3 000.

2.2.2对照品溶液制备

取大車前苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的对照品溶液，备用.

2.2.3供试品溶液制备

将车前草样品干燥后，粉碎过2号筛，取样品粉末约0.5 g，精密称定， 置于50 mL锥形瓶中，加入 60%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（温度30 ℃，频率300 W，功率50 kHZ） 40 min，放冷，再次称定质量，用 60%甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液.

2.2.4方法学考察

1）系统适用性试验.精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液与“2.2.3”项下供试品溶液各10 μL，按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定.结果表明，供试品溶液与对照品溶液的保留时间一致，分离度均大于1.5.

2）本研究已经进行线性、仪器精密度、稳定性、重复性和加样回收试验，结果均符合相关要求.

2.2.5样品测定

按照“2.2.3”项下制备51批车前草供试品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，HPLC图谱如图3和图4所示，结果见表1.图谱将采用HPLC法测得的含量作为参比，借助偏最小二乘回归算法建立车前草中大车前苷的定量校正模型，并对未知样品中大车前苷含量进行预测.

2.2.6车前草NIR模型的建立

从51批车前草样品中随机选取CQC20201201、CQC20201205、CQC20201209、CQC20201215、CQC20- 201221、CQC20201225、CQC20201230、CQC202012- 35、CQC20201241和CQC20201248共10批车前草样品作为验证集样.余下41批次车前草作为校正集样.

2.2.7车前草NIR图谱采集

将 NIR分析仪开机预热30 min，将41批车前草粉末样品（过2号筛）放入样品袋中，压实样品直至不松动，再把样品袋对准垂直的仪器进行测定.仪器基线噪声值 0.000 01，光源能量值 35 927，基线重复性值 0.000 1，波长准确性值 0.402，波长重复性值 0.002，吸光度重复值 0.000 1，测量模式均为正常［12］.光谱扫描时，参比为仪器内置背景，扫描次数 32 次，分辨率值为 8 cm-1，扫描范围为 900～1 800 cm-1［13］. 41批车前草样品NIR原始叠加图谱如图5所示.图541批车前草样品NIR原始叠加图谱2.2.8光谱预处理

光谱预处理应选择最适合的方法，这样不仅能除去噪声的干扰，还能减少杂光、散光及样品物理状态等因素对模型准确性的影响.本研究所用的化学计量学分析软件V2.6.1.0具有多种光谱预处理的方法，例如，消除常数偏移量、矢量归一化和一阶导数等［14］.本研究对叠加光谱图进行了前处理和波段选择，消除了噪声比较大的波段，结果如图6所示.图641批车前草样品NIR精简图谱2.2.9校正模型的建立

利用化学计量学分析软件V2.6.1.0的优化功能完成模型的构造，做完内部交叉检验，从而确定一定参数作为指标性参考，包括系数、内部交叉验证均方差和相对分析误差等，获得车前草中大车前苷最优的校正模型.本研究把41份校正集车前草样品的NIR图谱和HPLC法测定值运用偏最小二乘回归算法拟合，使用留一法进行内部交互验证，从而达到模型验证，得到模型的主因子数，确定车前草中大车前苷含量的定量模型，将含量预测值与真实值进行比较.结果如图7所示.图7车前草中大车前苷定量模型校正曲线初步建立的车前草中大车前苷定量校正模型方程式为Y=0.99X+0.01，R2=0.993，表明模型准确性高.采用交叉验证标准误差和相关系数等相关数据对模型的优缺点进行客观评价.其中，定标标准偏差、相对分析误差、交叉检验标准误差、校正模型的决定系数、交叉验证相对分析误差和相关系数分别为0.043、7.030、0.265、0.600、1.140和0.993.

2.2.10模型验证

取验证集样品10批，利用已建立的定量模型进行外部交叉验证，如图8所示.图8车前草大车前苷定量模型外部验证结果获得预测的结果方程式为Y=0.992 05X+1.134 57，R2=0.998 4，结果证明预测值与参考值相关性接近，所建定量模型稳定可靠，可用于车前草样品中大车前苷含量的快速检测，具体结果见表2.

目前，多数中药有效成分不明，作用机制不清，其现行质量标准中测定的成分不能确定是指标性成分还是有效成分，这为中药质量控制带来了一定的难度.现代研究指出，中药及其复方制剂具有多成分、多靶点与多通路的特点，多个成分共同协调发挥药效作用［17-18］.本研究通过网络药理学对车前草的成分和相关通路进行分析，筛选出排名靠前的5种成分中包括《中国药典》2020年版中规定车前草的指标性成分大车前苷，从而验证了该指标测定的必要性与重要性.

本研究建立的NIR快检技术，能够快速、准确地进行现场质量评价，样品处理操作简单，在不耗损样品的情况下可对车前草中大车前苷进行高效率、精准和稳定地测定.在车前草成熟期采收及销售现场即可满足产品等级的划分，可以减少质量把关不足的缺点，同时减少检测时间，提高工作效率.

本研究建立了车前草中大车前苷快速检测模型，用已建立的定量模型进行外部交叉验证，预测的结果与《中国药典》2020年版中的方法测定值较为接近.NIR快速测定为间接分析法，其准确性与大量有代表性的样品的数量密切相关，因此为了确保测定的准确性及稳定性，应该要提高各地区的样本数量，对不同产地与不同阶段的车前草应重新建立对应的模型.

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Study on Plantaginis Herba Content Based on Active Ingredient Screening and Near-Infrared Rapid Detection Technology

LIU Xiaofeng1，YANG Fang2，LIANG Hong1，XIONG Yi1，LIANG Qing1，YUAN Ningyao1，YE Meng3

（1.Private Sichuan Tianyi College，Deyang 618213，China;2.Chengdu Tianhe Traditional Chinese and Western Medicine Science and Technology Conservation Co.，Ltd.，Chengdu 510000，China;3.School of Pharmacy，Chengdu University，Chengdu 610106，China）

Abstract：

The active ingredients in Plantaginis herba were studied by using cyber pharmacology.The HPLC method was used to establish the method to determine the content of the index component psyllium.The content was used as a reference to establish a quantitative correction model of Plantaginis herba with the help of a partial least squares regression algorithm，and to predict the content of Plantaginis herba in unknown samples.The results of network pharmacology screened out the top active ingredients luteolin，skullcap，planin，hydroxylubelin and hispidulin.Standard deviation of psyllium epigride calibration，relative analysis error，standard error of cross-examination，coefficient of decision of the corrected model，cross-validation relative analysis error and correlation coefficient were 0.043，7.030，0.265，0.600，1.140 and 0.993.It could be concluded that the qualitative model established in this study was fast，efficient and reliable，and could be used for the quality control of Plantaginis herba psyllodyl.

Key words：

Plantaginis herba;cyber pharmacology;content determination;near-infrared rapid detection technology;quantitative models