基于转录组学策略分析川银花对耐药铜绿假单胞菌生物被膜的影响

赵玉婷 廖黎 王镜雅 杨晨 鲁兰

文章编号：1004－5422（2023）02－0119－06

DOI：10.3969/j.issn.1004-5422.2023.02.002

收稿日期：2022-06-27

基金项目：国家自然科学基金项目（81803812）；四川省科技厅科技创新苗子工程项目（2022046）

作者简介：赵玉婷（1998—），女，硕士研究生，从事天然产物抗感染药物的筛选研究.E-mail：1142774770@qq.com

通信作者：鲁兰（1983—），女，博士，研究员，从事抗感染小分子药物的筛选及机制研究.E-mail：345747278@qq.com

摘要：采用结晶紫染色法、扫描电镜法观察亚抑菌浓度川银花水煎液对耐药铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响，并从整体水平上运用转录组学技术分析耐药铜绿假单胞菌基因表达情况，对差异基因进行功能富集及通路分析.结果显示，转录组测序共筛选出362个差异表达基因，其中下调基因206个，上调基因156个，可为耐药铜绿假单胞菌在临床上感染造成的相关疾病的治疗提供新思路.

关键词：川银花；转录组学；铜绿假单胞菌；亚抑菌浓度；生物被膜

中图分类号：R965

文献标志码：A

0引言

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是极易引起慢性感染的常见病原菌之一［1］.PA的耐药机制繁多，且极易形成多药耐药（multi-drug resistance，MDR-PA）菌株，MDR-PA菌株的不断增加，使一线抗菌药物难以治疗PA感染［2-3］.中药在抗感染方面受到越来越多关注，具有多途径、多组分与多靶点的特点，毒副作用小且不易产生耐药性，凸显了其在抗菌治疗中的良好应用前景［4］.川银花为忍冬科忍冬属植物细毡毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、保肝、抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎等药理作用［5］.有研究通过性状鉴别、显微鉴别与超高效液相色谱法（UPLC）指纹图谱比较了川银花、金银花与山银花的异同，发现3种中药的成分具有一定相似性，且川银花的酚酸类成分占比最大［6］，中药的酚酸类物质是其抗菌的功效成分［7］.金银花对PA、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌与蜡样芽孢杆菌等有一定的抑菌活性［8-9］.研究发现，金银花对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌与多重耐药肺炎鏈球菌等5种儿童呼吸道多重耐药菌具有较好的抑菌效果；金银花水煎剂在体外可通过消除R质粒的方式逆转产金属酶PA的耐药性［10-11］.目前关于川银花抑制临床耐药菌的作用机制研究较少，细菌生物被膜的形成是细菌产生耐药性的典型机制之一，可阻止药物穿入并逃逸宿主的免疫系统，是目前抗耐药性研究的热点.转录组学技术已经成为中药研究中的重要方法［12-14］，本研究以收集的临床常见致病耐药PA菌株为对象，观察川银花的水煎液对PA菌株生物被膜的影响，采用转录组学技术从整体水平分析耐药PA菌株基因表达情况，探究川银花抑制耐药PA菌株生物被膜的作用机制.

1材料

1.1仪器

HFsafe 1200型超净工作台（上海力申科学仪器有限公司），LDZX-75L型立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），GNP-9080型隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），CR-2032型数显游标卡尺（德清盛泰芯电子科技有限公司），ELx-800型光吸收酶标仪（美国伯腾仪器有限公司），ZHWY-100B型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司），Regulus 8100型扫描电子显微镜（SEM）（日立高新技术有限公司）.

1.2材料

川银花，购自成都市荷花池中药材市场，经四川抗菌素工业研究所鲁兰研究员鉴定为忍冬科忍冬属植物细毡毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花；PA质控菌株（编号，ATCC27853），购自美国标准菌种收藏所；3株临床分离PA菌株，由四川抗菌素工业研究所提供；MH（A）培养基（批号，20200730），购自北京奥博星生物技术有限责任公司；结晶紫（批号，115Y041）、琼脂粉（批号，909A027）、LB 培养基（批号，20210527），均购自索莱宝科技有限公司；胰蛋白胨（批号，2426150），购自英国Oxoid公司； 无菌96孔板（批号，072020BA01），购自无锡耐思生命科技股份有限公司；麦氏比浊仪（批号，075870），购自广东环凯微生物科技有限公司.

2方法与结果

2.1药液制备

称取川银花80 g，用洁净纱布包好放置于煎药壶中，加入超纯水1 000 mL，武火煮沸后切换为文火煎2 h，倒出取药液，加入1 000 mL超纯水，按此方法继续煎煮药液，过滤合并2次药液，浓缩至10 mL，此时药液浓度为8 000 mg/mL，121℃灭菌30 min，使用时现配现用.

2.2筛选耐药PA菌株

将复苏质控菌株ATCC27853与临床分离PA菌株用无菌生理盐水调整菌悬液麦氏比浊度为0.5，用无菌棉签伸入菌悬液蘸取适量菌液后，将菌液在MH（A）平皿上涂布均匀，晾干平皿，于平皿合适位置放置美罗培南、亚胺培南与左氧氟沙星药敏纸片，10 min内倒置平板，35～37 ℃下培养16～18 h.PA菌株的耐药性根据相关的标准来判定，使用游标卡尺准确读取抑菌圈的直径［15］.

筛选出3株耐3种抗生素的PA菌株，名称依次为PA101、PA102和PA103，3种抗生素对耐药PA和ATCC27853菌株的抑菌圈直径结果见表1.ATCC27853菌株的抑菌圈直径结果均处于质量控制（QC）范围内，美罗培南和亚胺培南对3株临床PA菌株的抑菌圈直径均≤15 mm，左氧氟沙星对3株临床PA菌株的抑菌圈直径均≤13 mm.菌物的最低抑菌浓度（MIC）是未见细菌生长时的最低药物浓度.

采用琼脂二倍稀释法，分别于无菌平皿内加入浓度为8 000 mg/mL的川银花水煎液1 mL，50 ℃ MH（A）培养基14 mL，混匀，使每皿中所含的川银花水煎液终浓度依次为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81和3.91 mg/mL；另外再配制左氧氟沙星作為阳性对照组，于无菌平皿内加入1 mL浓度为1 920 μg/mL左氧氟沙星， 50 ℃ MH（A）培养基14 mL，混匀，使每皿中所含左氧氟沙星的终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015和0.008 μg/mL.待平皿中的含药琼脂培养基冷却凝固后，用多点接种仪接种稀释好的菌液，并且设立不含药的菌对照组， 35～37℃下培养18～24 h.

川银花水煎液对ATCC27853和3株耐药PA菌株的MIC值见表2.左氧氟沙星对ATCC27853和3株耐药PA菌株的MIC值分别为1、32、16和16 μg/mL，川银花对ATCC27853和3株耐药PA菌珠的MIC值均为250 mg/mL.结合前期的药敏纸片结果，采用PA101菌株进行后续实验.

2.4亚抑菌浓度对菌株生物被膜的影响在TSA平皿上将耐药PA101菌株培养18～24 h，挑取数个单菌落于营养肉汤中，调至菌悬液麦氏比浊度为1.0，用营养肉汤稀释10倍备用.在96孔板第2～3列加入无菌营养肉汤100 μL，作为菌对照组；第4～7列分别加入浓度为500、250、125、62.5 mg/mL的川银花水煎液各100 μL，每列6个复孔；再在第2～7列的6个复孔中加入稀释好的菌液100 μL，使第4～7列川银花药物终浓度依次为250、125、62.5、31.25 mg/mL，即川银花药物浓度范围为 1 MIC～1/8 MIC；其余孔加入200 μL的营养肉汤培养基.于35～37 ℃恒温培养箱中，培养72 h.培养结束后，吸弃96孔板中每孔的剩余培养液，用灭菌生理盐水漂洗3次，去除浮游菌，加入250 μL 浓度为2 %的结晶紫溶液染色10 min，用无菌生理盐水缓慢洗去多余结晶紫，加入250 μL无水乙醇溶解PA菌株生物被膜，在波长为570 nm 处用酶标仪测定各孔吸光度值［16-17］.

亚抑菌浓度的川银花水煎液对PA101菌株生物被膜的影响作用见表3.与菌对照组相比，川银花水煎液在亚抑菌浓度为125和62.5 mg/mL（即1/2 MIC和1/4 MIC）时，对PA101菌株生物被膜形成有抑制作用（P＜0.01和P<0.05）.川银花水煎液浓度在250 mg/mL（即1MIC）时，抑制PA101菌株生长，也抑制其生物被膜形成.

2.5亚抑菌浓度对菌株生物被膜形态学的影响盖玻片经高压灭菌后置于无菌 6 孔平底培养板中，每孔 2 片，斜放在孔中，菌对照组加入2 mL肉汤培养基，低、中和高剂量组分别加入2 mL的含药物质量浓度为1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的肉汤液体培养基，将200 μL的1×104 CFU /mL的PA101菌体混悬液加入6孔板中，封口膜密封，37 ℃孵育 72 h 后取出盖玻片，弃去培养基，用高压灭菌的PBS缓冲液缓缓漂洗各孔盖玻片3次，去除浮游菌，用2.5%的戊二醛固定12 h，SEM形态学观察.

亚抑菌浓度的川银花水煎液对PA101菌株生物被膜的作用如图1所示.SEM图显示，川银花对PA101生物被膜的抑制作用随药物质量浓度增加而加强，其中生物被膜产生量为菌对照组＞1/8 MIC＞1/4 MIC＞1/2 MIC.

2.6转录组测序及差异表达基因分析

复苏PA101菌株，置35～37 ℃下培养18～24 h，用灭菌生理盐水调至菌悬液麦氏比浊度为1.0，LB培养基稀释菌量至5×106  CFU/mL左右.在150 r/min、37 ℃条件下培养3～4 h，测定菌液麦氏比浊度为0.5左右.设立不含药液的菌对照组，给药组则在培养液加入适量川银花水煎液，使药物终浓度为62.5 mg/mL（即1/4 MIC），37 ℃恒温培养18～24 h.然后在4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，吸弃培养液，用灭菌生理盐水洗涤PA101菌株3次，然后在4℃、8 000 r/min条件下离心10 min，吸干生理盐水，于-80 ℃贮存样品，菌对照组和给药组各取3个平行样品检测.用 DEGseq2 软件分析2组基因差异表达，下调差异基因筛选标准为P＜0.05，log2 Fold Change<-1；上调差异基因的筛选标准为log2 Fold Change>1，|log2 Fold Change|＞1.分析结果表明，给药组与菌对照组进行比较，有362个表达基因发生明显变化，包括上调基因156个，下调基因206个，结果如图2所示.其中，绿色代表下调基因，红色代表上调基因，蓝色代表无显著差异基因.

2.7差异表达基因GO生物富集和KEGG通路分析差异表达基因GO生物富集在DAVID数据库中分析，筛选标准为P＜0.05，并绘制生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）GO结果注释图.差异基因的KEGG通路分析在KOBAS数据库中进行.

在差异表达基因进行GO生物富集分析结果中，满足筛选标准的上调基因MF和BP条目共9个，如图3（A）所示.BP主要富集在阴离子跨膜转运、有机酸跨膜转运与羧酸跨膜转运；CC没有显著富集；MF主要富集在电子转移活性、血红素结合与NADP结合等.BP、MF和CC条目中满足筛选标准的下调基因共12个，如图3（B）所示.BP大部分富集在α-氨基酸代谢过程、α-氨基酸分解代谢过程、细胞—氨基酸分解代谢过程、硫化合物代谢过程、天冬氨酸家族氨基酸代谢过程与氧化还原过程；CC主要富集在外膜边界质周空间；MF主要富集在铁离子结合与抗氧化活性等过程.

对差异表达基因进行KEGG通路分析，由筛选标准得到13条与上调基因相关的通路，如图4（A）所示.富集在抗生素的生物合成、不同环境中的微生物代谢、碳代谢、吩嗪生物合成、代谢途径、次级代谢产物的生物合成、糖酵解/糖异生、果糖和甘露糖代谢、磷酸转移酶系统（PTS）、戊糖磷酸途径、精氨酸生物合成、柠檬酸循环（TCA循环）与氮代谢.下调基因得到14条通路，如图4（B）所示.富集在代谢途径、阳离子抗菌肽（CAMP）耐药性、色氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、群体感应、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、生物被膜形成-PA、卟啉与叶绿素代谢、碳代谢、赖氨酸降解、甘油磷脂代谢、次级代谢产物的生物合成与芳香族化合物的降解.

3讨论

PA是常见的条件致病菌之一，其引起的相关感染性疾病的治疗及严重耐药现象的出现成为临床的棘手问题［18］.研究发现，许多中草药在抗菌、抗病毒及逆转耐药性方面具有确定的活性作用［19-20］.中药是具有多途径、多组分与多靶点等特点的复杂化合物体系，近年来多组学技术已广泛应用于生物系统的整体变化水平研究中［21-22］.转录组学技术可以从整体水平上研究中药干预前后细胞或组织中系列的基因变化情况，组学技术的应用更有利于对中药的作用机制进行全面而系统地研究［23-24］.

觀察亚抑菌浓度川银花水煎液对临床耐药PA101菌株生物被膜形成的影响发现，川银花水煎液能抑制PA101菌株生物被膜的形成，并且生物被膜的形成量随着川银花药物质量浓度增加而减少.通过转录组测序技术发现，川银花水煎液作用后，PA101菌株中有362个表达基因发生明显变化，其中206个下调基因，156个上调基因.

群体感应系统（quorum sensing，QS）是一种细菌细胞间的信号传递机制，在细菌生物被膜形成过程中，QS具有重要调控作用.下调基因主要富集在代谢途径、CAMP耐药性、色氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、群体感应、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢与生物被膜形成-PA等生物学途径.本研究利用转录组学技术，发现亚抑菌浓度川银花水煎液能抑制耐药PA菌株生物被膜的形成，作用的机制可能是通过下调相关基因的表达来影响细菌的QS或氨基酸代谢等途径，从而抑制PA菌株生物被膜的形成，为耐药PA菌株在临床上感染造成的相关疾病的治疗提供新思路.

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（责任编辑：伍利华）

Effect of Lonicerae Similis Flos on Biofilm of Drug-Resistant Pseudomonas Aeruginosa Based on Transcriptomics Strategy

ZHAO Yuting，LIAO Li， WANG Jingya，YANG Chen，LU Lan

（Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu University，Chengdu 610052，China）

Abstract：

This study investigated the effect of sub-MICs of Lonicerae similis flos decoctions on the formation of biofilm of clinical drug-resistance  pseudomonas aeruginosa（PA） .Crystal violet staining and scanning by electron microscopy were applied to observe the effect.And transcriptomics was used to analyze the gene expression of drug-resistance  PA  at the overall level，and analyze the function enrichment and pathway of these genes.A total of 362 differentially expressed genes were screened by transcriptome sequencing，including 206 down regulated genes and 156 up-regulated genes so as to explore the potential mechanism of sub-MICs of Lonicerae similis flos decoctions inhibiting the biofilm of clinical drug-resistance  PA and provide new ideas and a series of references for the treatment of related diseases caused by clinical infection of drug-resistant pseudomonas aeruginosa.

Key words：

Lonicerae similis flos;transcriptomics;pseudomonas aeruginosa;sub-minimum inhibitory concentration;biofilm