叠鞘石斛组织培养及植株再生体系优化

张珏 邬江 赵心怡 刘帆

文章编号：1004－5422（2023）02－0139－07

DOI：10.3969/j.issn.1004-5422.2023.02.005

收稿日期：2022-10-24

基金項目：四川中医药文化协同发展研究中心项目（2021XT42）

作者简介：张珏（1976—），女，博士，讲师，从事药用植物资源利用与开发研究.E-mail：8926596@qq.com

通信作者：刘帆（1967—），男，硕士，副教授，从事药用植物种苗繁育研究.E-mail：541169023@qq.com

摘要：以叠鞘石斛成熟种子为材料，使用IBA、6-BA和NAA共3种生长调节剂与香蕉泥和椰子汁有机物等组合，采用3因素3水平正交设计及单因素设计进行组织培养研究.结果显示，最佳叠鞘石斛原球茎培养基为MS+50 g/L椰子汁+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，40 d增殖系数为6.75，分化率为84.38%；最佳叠鞘石斛壮苗生根培养基为1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂.通过该技术，可以在较短时间获得大批量优质叠鞘石斛种苗，为大规模叠鞘石斛药材生产提供基础.

关键词：叠鞘石斛；生长调节剂；组织培养；形态指标；植物再生；炼苗

中图分类号：S567.239

文献标志码：A

0引言

叠鞘石斛（又称迭鞘石斛）为兰科石斛属多年生草本植物，以茎入药，收载于《四川省中药材标准》中.其味甘、微寒，具有益胃生津，滋阴清热等功效［1］.叠鞘石斛在生产过程中，以无性繁殖为主，主要采用分株繁殖方式［2］，该方法费时费力，且环境适应性较差，不适合为大规模生产提供种苗.

目前对叠鞘石斛组织培养研究较少，已有研究表明，一定浓度的香蕉泥和椰子汁有利于石斛属植物原球茎增殖［3-5］.6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）是一种具有多种生物功能的植物生长调节剂，除了能促进细胞分裂，也可以促进种子发芽，抑制或促进根的生长；3-吲哚丁酸钾（IBA）促进生根作用较强，但产生的不定根细而长；萘乙酸（NAA）促进根生长和芽的分化作用较强.当适宜浓度的6-BA与适宜浓度的NAA与IBA混合使用，既有利于原球茎的增殖分化，又可以提前生根发芽，明显促进根系生长［6-9］. 因此本研究采用植物组织快速培养方法，通过对培养基中生长调节剂的配比与有机添加物的浓度等进行筛选，探究叠鞘石斛组培苗的最佳增殖有机物浓度与增殖培养条件，建立叠鞘石斛快速繁殖体系.

1材料与方法

1.1材料

叠鞘石斛成熟种子，由四川省雅安市石棉县丰乐乡种植基地提供，经四川农业大学田孟良教授鉴定为叠鞘石斛种子.

1.2方法

1.2.1原球茎诱导培养

以成熟未开裂、外表有黄褐色斑点的叠鞘石斛蒴果为外植体，对蒴果进行灭菌处理后，吸干外表水分，将其切开，抖动果荚将种子均匀撒播于MS空白培养基中.培养温度为（23±2）℃，光照时数为12 h/d，光照强度为35～40 μmol/m2·s.

1.2.2原球茎增殖培养

以叠鞘石斛种子萌发出的原球茎为试验材料，以市售新鲜成熟香蕉与椰子作为天然有机物附加物，香蕉切块、捣碎，椰子取其汁液.采用单因素设计，并设置各有机物浓度梯度，见表1.将有机物分别添加到MS空白培养基.选出大小基本一致的原球茎，每瓶接种2丛（每4个原球茎为1丛），每处理接种10瓶，3次重复.培养温度为（23±2）℃，暗培养7 d后，再转入光照恒温室培养，光照时数为12 h/d，光照强度为35～40 μmol/m2·s.每3 d观察1次并记录数据，40 d后统计结果.

1.2.3壮苗生根培养

以不定芽生长高度约2.5 cm，长势基本一致的叠鞘石斛组培苗为试验材料，采用3因素3水平正交试验设计，设置生长调节剂浓度配比，共9个处理组，见表2.将生长调节剂分别添加到培养基（1/2 MS），每瓶接种2株，每个处理15瓶，3次重复.采用光照恒温培养，温度（23±2）℃，光照时数为12 h/d，光照强度为35～40 μmol/m2·s，每3 d观察1次.

1.2.4炼苗移栽

当约80%的苗生长高度达到约4 cm，根长约3 cm时，开盖后于温室炼苗，炼苗3 d后将苗取出，用清水洗去根部培养基后移栽至由红砂石∶松树皮∶苔藓比例为2∶1∶1的基质中，每个处理移栽10株苗，3次重复.温度保持在（23±2）℃，每隔3 d浇水并记录组培苗生长情况，30 d后统计存活率.

2结果与分析

2.1种子萌发

叠鞘石斛种子在40 d内随时间的增长萌发率逐渐提高，由黄色粉状种子发育成黄绿色原球茎，直径1.0 mm左右，形如芝麻粒，部分直径2.5 mm左右，如绿豆大小，结果见表3和图1，

2.2原球茎增殖

由叠鞘石斛原球茎增殖试验结果可知，100 g/L椰子汁的增殖效果最佳，40 d原球茎增殖系数为8.25；其次是50 g/L椰子汁，增殖系数为6.75；空白培养基增殖效果最差，增殖系数为3.25.随有机物浓度的增加，原球茎的增殖系数也随之提高，40 d原球茎增殖效果均优于空白培养基，且色泽浅绿、生长致密、健壮.结果见表4和图2.

2.3原球茎分化

由叠鞘石斛原球茎分化试验可知，50 g/L椰子汁分化效果最佳，40 d原球茎分化率为84.38%；空白培养基分化率最低，为67.65%.添加了香蕉泥或椰子汁的培养基，分化苗颜色浅绿，分化程度均高于空白培养基.添加香蕉泥（50 g/L）的培养基，分化苗虽高但较细长，且有少数畸形；而添加椰子汁的培养基，分化苗整齐且粗壮.结果见表5和图3.

2.4生长调节剂对生长的显著性差异

由生长调节剂对叠鞘石斛生长影响试验可知，IBA对叠鞘石斛的主根长度、侧根数目、株高与茎粗均有极显著性影响（P<0.01）；6-BA对叠鞘石斛的茎粗有极显著性影响（P<0.01）；NAA对叠鞘石斛的主根长度、侧根数目与株高有极显著性影响（P<0.01）.3种生长调节剂对叠鞘石斛的叶片数均无显著性影响（P>0.05），结果见表6.

2.4.1IBA对壮苗生根的影响

IBA对叠鞘石斛壮苗生根的影响结果见表7.在主根长度方面，最佳浓度为0.5 mg/L，且与0.1 mg/L及1.0 mg/L相比，均出现显著（P＜0.05）提高作用；同理，在侧根数目方面，最佳浓度为1.0 mg/L；在株高方面，最佳浓度为0.1 mg/L；在茎粗方面，最佳浓度为0.5 mg/L.

2.4.26-BA对壮苗生根的影响

6-BA对叠鞘石斛壮苗生根的影响结果见表8.

2.4.3NAA对壮苗生根的影响

NAA对叠鞘石斛壮苗生根的影响结果见表9.在主根长度方面，最佳浓度为0.1 mg/L，与其他组相比，均出现显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）提高作用；在侧根数目方面，最佳浓度为0.5 mg/L；在株高方面，最佳浓度为0.1 mg/L，与0.5 mg/L及1.0 mg/L相比，均出现显著（P<0.05）提高作用；在茎粗方面，最佳浓度为0.5 mg/L，但与0.1 mg/L及1.0 mg/L相比，差异均不显著（P>0.05）.

2.5壮苗生根与炼苗移栽

单一生长调节剂对叠鞘石斛壮苗生根培养无影响则Kx（Kx代表对应水平生长调节剂的试验指标和，kx代表Kx的平均值，x=1、2和3）相等，Kx不相等则有影响，且Kx越大，影响越大.根据极差R的大小，可以判断各生长调节剂对试验指标的影响主次.实验结果详见表10.

从主根长度单方面分析，IBA的K2、6-BA和NAA的K1最大，说明促进主根生长的最佳生长调节剂配比为0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其中IBA的极差最大，NAA次之，6-BA最小，故各生长调节剂对叠鞘石斛组培苗主根长度的影响主次顺序为IBA＞NAA＞6-BA；从侧根数目单方面分析，IBA的极差最大，NAA次之，6-BA最小，故各生长调节剂对叠鞘石斛组培苗侧根数目的影响主次顺序为IBA＞NAA＞6-BA；从株高单方面分析，各生长调节剂对叠鞘石斛组培苗株高的影响主次顺序为IBA＞NAA＞6-BA；从茎粗单方面分析，各生长调节剂对叠鞘石斛组培苗茎粗的影响主次顺序为IBA＞6-BA＞NAA.组培苗与移栽苗如图4和图5所示.

3.1MS培养基对种子萌发影响

MS培养基是植物组织培养中应用最为广泛的一种培养基，大多数兰科植物均可在MS培养基中萌发.郑志仁等［10］发现，野生铁皮石斛在多种培养基中1个月的萌发率，以MS培养基萌发率最高，高达87%；方香香等［11］发现，霍山石斛在MS培养基中萌发率可达85.46%.在叠鞘石斛种子萌发阶段采用MS培养基，不添加生长调节剂就能萌发出原球茎，且40 d萌发率＞90%，证明了叠鞘石斛种子萌发可以不需要外源生长调节剂.

3.2有机物对原球茎增殖分化的影响

植物组织培养中不同种类与不同浓度有机物对石斛属植物诱导生根发芽都有显著影响.研究发现，一定浓度的香蕉泥和椰子汁有利于石斛属植物原球茎增殖［3-5］，香蕉泥与椰子汁等有机物能够对石斛芽增殖和原球茎的形成有明显的促进作用［6］，本研究结果与之相符.添加香蕉泥和椰汁的组培苗生长得更好，移栽成活率高，可能是其不僅含有较多的碳水化合物，还含有多种氨基酸、钾和钙等营养元素，可以显著促进细胞的增殖［8］.本研究结果显示，叠鞘石斛原球茎的增殖效果最佳有机物浓度为100 g/L椰子汁；原球茎的分化以浓度为100 g/L香蕉泥与50 g/L椰子汁最佳.

3.3生长调节剂对壮苗生根的影响

植物生长调节剂对植物生长发育具有两面性，既有促进萌发、生根、生长、成熟和增加产量等作用，也能抑制器官发育和生长.6-BA、IBA和NAA是植物组织培养中常用的生长调节剂.本研究表明，适量的IBA、6-BA和NAA对叠鞘石斛壮苗生根都有一定促进作用，与黄勇等［12］研究生长调节剂对铁皮石斛壮苗生根的影响，以及陈春［13］研究独角石斛快繁的结果相对一致.

3.4炼苗移栽与工厂化生产

本研究采用由红砂石、松树皮与苔藓配比为2∶1∶1的基质，成本低廉且组培苗存活率高达99%.此外，叠鞘石斛及其他石斛属植物一般2年成苗，3年才可长出新芽.仇硕等［14］发现，报春石斛从种子萌发到移栽成苗的快繁培养需240 d左右.本研究从叠鞘石斛种子萌发到移栽成苗，共计170 d.缩短了叠鞘石斛成苗时间且成活率高，同时能保证优质种苗稳定生产.

4结论

叠鞘石斛组培苗根部最佳生长调节剂配比为0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA;叠鞘石斛组培苗株高最佳生长调节剂配比为0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA;叠鞘石斛组培苗茎粗最佳生长调节剂配比为0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA.最佳叠鞘石斛壮苗生根培养基为1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂.叠鞘石斛组培苗移栽驯化采用由红砂石、松树皮与苔藓配比为2∶1∶1的基质，不同生长调节剂配比培养的组培苗移栽后均长势健壮，30 d后总成活率为99%.快繁培养操作较为简便，成本较为低廉，适合叠鞘石斛优质株系的挑选及工厂化生产.

參考文献：

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［11］方香香，谢欢，伍奥林，等.霍山石斛快速繁殖技术研究［J］.中国现代中药，2015，17（6）：529-532.

［12］黄勇，张铁，郭云亮.铁皮石斛壮苗生根正交实验［J］.园艺与种苗，2017，37（10）：28-30.

［13］陈春.独角石斛组培快繁技术［J］.亚热带农业研究，2019，15（4）：257-261.

［14］仇硕，赵健，赵志国，等.报春石斛组培快繁技术体系的建立［J］.北方园艺，2019，43（3）：78-83.（责任编辑：伍利华）

On Optimization of Tissue Culture and Plant Regeneration System of Dendrobium Aurantiacum Rchb.f.var.Denneanum（kerr） Z.H.Tsi

ZHANG Jue1，WU Jiang2，ZHAO Xinyi3，LIU Fan3

（1.School of Pharmacy，Chengdu University，Chengdu 610106，China;

2.The Affiliated Primary School of Chengdu University of Technology，Chengdu 610051，China;

3.College of Agronomy，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）

Abstract：

Mature seeds of Dendrobium aurantiacum Rchb.f.var.denneanum （kerr） Z.H.Tsi were used as experimental materials，IBA，6-BA，NAA，mashed banana，and coconut juice were added in and three factors and three levels orthogonal design and single factor design were adopted.The study showed that the best corm culture medium was MS+50 g/L coconut juice+30 g/L sucrose + 6 g/L agar，the proliferation coefficient was 6.75 and the differentiation efficiency was 84.38% at 40 days.The best culture medium for strong seedling and rooting was 1/2 MS+ 0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L sucrose + 6 g/L agar.It can be concluded that this tissue culture system can provide Dendrobium aurantiacum seedlings rapidly and also provide basis for the generous producation of this medicinal plants.

Key words：

Dendrobium aurantiacum Rchb.f.var.denneanum （kerr） Z.H.Tsi;growth regulator;tissue culture;shape indicators;plant regeneration;acclimatization