冻融卵裂期胚胎与囊胚移植的妊娠结局及第二性别比的比较

余柯达 毛佳婷 包云 柴娟 高辉 师帅

第二性别比（secondary sex ratio，SSR）是出生时男婴与女婴数量的比值。在自然生育条件下出生婴儿的SSR 为（106～110.2）∶100[1]，而通过辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）助孕出生婴儿的SSR 显著高于自然生育条件[2]。随着社会的发展，通过ART 助孕出生的人口比例逐年增加，未来可能会对人口构成产生不良影响。目前在ART 治疗中不同发育阶段的胚胎移植对SSR 的影响尚有争议，多数研究结果表明囊胚与卵裂期胚胎移植后的SSR 无显著差异性[3-7]，部分研究则表明囊胚移植后的SSR 显著高于卵裂期胚胎[8-9]。丁锦丽等[10]通过Meta 分析发现，在新鲜周期中囊胚移植会使SSR 显著升高，而对冻融周期未作探讨。因此，有必要进一步探究冻融周期中不同发育阶段胚胎移植对妊娠结局及SSR 的影响，从而为临床实践提供借鉴。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019 年6 月至2021 年3 月在金华市人民医院生殖医学中心行冻融胚胎移植的977 个周期。根据移植胚胎的发育阶段分为第3 天卵裂期胚胎组（D3 组，699 个周期）和第5 天囊胚组（D5 组，278 个周期）。纳入标准：（1）患者年龄＜40 岁；（2）接受体外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗的患者；（3）首次进行胚胎移植的周期。排除标准：（1）有习惯性流产史；（2）子宫因素不孕；（3）病例资料不全。本研究经本院医学伦理委员会审查通过（批准文号：IBR-2019066-R），所有患者均知情同意。

1.2 胚胎培养 根据患者情况采用对应的促排卵方案，患者注射重组人绒毛膜促性腺激素（商品名：艾泽，德国默克雪兰诺有限公司）34～36 h 后，在B 超引导下经阴道穿刺取卵，行IVF/ICSI 授精，16～18 h 后观察受精情况，双原核为正常受精，D3 组于第3 天观察胚胎卵裂情况，D5 组于第5 天观察囊胚形成情况。卵裂期胚胎和囊胚的评价参考本院生殖医学中心[11]和Gardner 等[12]的评分标准。

1.3 玻璃化冷冻与复苏 D3 组的可利用胚胎和D5 组的可利用囊胚均采用玻璃化冷冻试剂盒（日本加藤公司）进行冷冻保存。将待冷冻的胚胎放入平衡液ES 中放置8～15 min，观察到胚胎体积先收缩再恢复后，随即将其转移至玻璃化冷冻液VS 中，在45～60 s 内将胚胎加载至玻化冻存管（江苏苏云医疗器材有限公司）上，最后将其迅速投入液氮中。卵裂期胚胎和囊胚的复苏均采用玻璃化解冻试剂盒（日本加藤公司）。将加载有胚胎的玻化冻存管迅速从液氮转移至解冻液TS中放置1 min，然后将胚胎转移至稀释液DS 中放置3 min，再依次将其转移至洗涤液WS1 和洗涤液WS2中各放置5 min，最后将复苏后的胚胎放入胚胎移植液（瑞典Vitrolife 公司）中培养。

1.4 冻融胚胎移植 根据患者自身情况选择内膜准备方案。对排卵正常且内膜生长良好的患者一般采用自然周期，对于排卵异常、黄体功能不全或子宫内膜薄的患者则采用人工周期。患者于内膜转化后的第3 天移植卵裂期胚胎，第5 天移植囊胚。患者移植14 d 后测人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonad‐otrophin，hCG），hCG 阳性即生化妊娠，移植35 d 后进行B 超检查，可见孕囊的患者为临床妊娠，分娩后电话随访母婴情况。

1.5 观察指标 收集患者的一般信息和临床结局资料，包括患者年龄、不孕年限、BMI、移植胚胎数、生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎种植率、多胎妊娠率、异位妊娠率、流产率、总活产率（包括单胎活产率、双胎活产率）、孕周、新生儿出生体重（包括单胎出生体重、双胎出生体重）、早产率和SSR 等。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料组间比较采用χ2检验。将临床认为与妊娠结局有关、单因素分析P＜0.15 的变量纳入多因素logistic 回归模型，筛选与冻融周期胚胎移植妊娠结局相关的独立影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冻融周期卵裂期胚胎与囊胚移植的妊娠结局比较 D3 组和D5 组年龄、不孕年限、BMI、多胎妊娠率、异位妊娠率和流产率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。D5 组移植胚胎数少于D3 组，而生化妊娠率、临床妊娠率和胚胎种植率均高于D3 组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1。

表1 冻融周期卵裂期胚胎与囊胚移植的妊娠结局比较

2.2 冻融周期卵裂期胚胎与囊胚移植新生儿情况的比较 D3 组和D5 组孕周、双胎活产率、出生体重、单胎出生体重、双胎出生体重和早产率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。D5 组总活产率、单胎活产率和SSR 均高于D3 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 冻融周期卵裂期胚胎与囊胚移植新生儿情况的比较

2.3 影响冻融周期胚胎移植妊娠结局的多因素logis‐tic 回归分析 以妊娠结局为因变量（临床妊娠、出生男婴赋值=1，无临床妊娠、出生女婴赋值=0），将临床认为与妊娠结局有关、单因素分析P＜0.15 的因素作为自变量（年龄≤30 岁、BMI＜25kg/m2、卵裂期胚胎移植=0，年龄＞30 岁、BMI≥25 kg/m2、囊胚移植=1），进行多因素logistic 回归分析，逐步法排除无关项目。结果显示，年龄＞30 岁、移植胚胎数和囊胚移植是冻融周期临床妊娠的独立影响因素（均P＜0.05），囊胚移植是出生男婴的独立影响因素（P＜0.05），见表3。

表3 影响冻融周期胚胎移植妊娠结局的多因素logistic 回归分析

3 讨论

SSR 是男女性别平衡的重要指标，其受到多种因素的影响，SSR 的稳定对于社会稳定和经济发展具有重要意义。在ART 过程中，早期胚胎暴露于体外环境会对SSR 产生一定的影响，目前比较明确的是授精方式[13-14]。此外双亲年龄、移植胚胎类型（新鲜胚胎/冻融胚胎）和移植胚胎发育阶段（卵裂期/囊胚期）等也可能会影响SSR，但目前尚无明确定论[14]。胚胎序贯培养技术可以使早期胚胎顺利发育至囊胚阶段，在IVF/IC‐SI 治疗中选择囊胚移植，具有比卵裂期胚胎更高的胚胎种植率和临床妊娠率[15]。目前囊胚移植已被国内外各大生殖医学中心广泛应用。由于不同发育阶段的胚胎移植对SSR 的影响尚有争议，因此本研究对冻融周期中不同发育阶段的胚胎移植对妊娠结局及SSR 的影响进行了探讨。

本研究对冻融周期中的卵裂期胚胎与囊胚移植后的妊娠结局进行比较后发现，相比于D3 组，D5 组在移植胚胎数显著减少的情况下，具有更高的生化妊娠率、胚胎种植率和临床妊娠率，且总活产率和单胎活产率均升高，差异均有统计学意义，与Blake 等[15]的研究结果一致。本研究通过多因素logistic 回归分析发现，年龄＞30 岁、移植胚胎数和囊胚移植是冻融周期临床妊娠的独立影响因素，进行囊胚移植可以促进临床妊娠成功。在ART 治疗中囊胚移植具有比卵裂期胚胎更优的临床结局的原因可能是，人类胚胎基因组的激活是在第3 天卵裂期胚胎之后，未被激活的胚胎会被淘汰，因此囊胚培养进一步对胚胎进行了自然筛选[16]，且囊胚移植更符合自然的生理状况，胚胎-子宫内膜发育具有更好的同步性[17]。

本研究探讨了冻融周期中不同发育阶段的胚胎移植对SSR 的影响，结果发现D5 组SSR 高达146.75∶100，高于D3 组的101.12∶100，多因素logistic 回归分析显示，囊胚移植是冻融周期出生男婴的独立影响因素，与Li 等[3]和刘帅等[7]的研究结果不同，而与Chang等[18]和丁锦丽等[10]的Meta 分析结果一致。造成囊胚移植后的SSR 高于卵裂期胚胎的具体原因目前尚未明确。有研究结果显示，体外培养的男性胚胎从桑椹胚发育到囊胚阶段的葡萄糖代谢显著高于女性胚胎[19]，表明男性胚胎比女性胚胎拥有更快的发育速度[9，20]，目前的囊胚评价方法导致优质囊胚为男性胚胎的概率更大，而进行囊胚移植的策略是选择高质量的囊胚，从而导致ART 周期的SSR 升高。

目前不孕不育患者进行ART 治疗时，临床医生往往会选择给患者移植两个胚胎，以确保获得较高的临床妊娠率，但也会导致患者多胎妊娠的风险增加。多胎妊娠容易导致孕妇发生产前子痫、妊娠高血压综合征、妊娠期糖尿病、贫血和产后出血等严重并发症[21-22]。本研究结果表明，本中心冻融周期中D3 组和D5 组的多胎妊娠率高达33.81%和35.09%。因此在维持较高临床妊娠率的前提下，如何降低多胎妊娠率是本中心目前急需解决的问题。控制胚胎移植数是ART治疗中降低多胎妊娠率最有效的手段，本中心D5 组的胚胎种植率高达47.65%，而D3 组的临床妊娠率仅为49.93%，囊胚移植的胚胎种植率与卵裂期胚胎移植的临床妊娠率相当，因此本中心的移植策略可进一步探讨单囊胚移植的可行性，以减少多胎妊娠的发生。

综上所述，冻融周期中行囊胚移植具有更高的胚胎种植率和临床妊娠率，因此，建议将ART 周期中的早期胚胎培养至囊胚后再行移植或冷冻。目前国内各省市对ART 治疗进入基本医疗保险进行了讨论和试点，未来通过ART 出生的人口占比会越来越多，本研究结果表明冻融周期中囊胚移植会提高SSR，将来可能会对人口构成产生影响。因此未来可进一步对囊胚移植造成SSR 偏移的具体因素进行详细探讨，并制定新的囊胚选择和移植策略，以规避ART 治疗中的SSR 偏移。