肺腺癌伴恶性胸腔积液患者胸水细胞蜡块KCa3.1 的表达及其意义

何春晓 钱莹宽 沈雅敏 李经历 曹淼英

胸腔积液是晚期肺癌患者的常见体征，任何一种病理类型的肺癌都可以引起胸腔积液，其中最常见的是肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）[1]。晚期肺癌患者有时较难获取组织学标本，抽取胸腔积液行细胞学检查相对容易，因此对于有胸腔积液的肺癌患者，胸水细胞蜡块检测可作为诊断肺癌病理类型和指导临床治疗的主要手段[2]。与组织学检查相比，胸水细胞蜡块检测的诊断准确性较低，因此需要更加敏感的检测指标用以提高个体化治疗和预后预测的准确性。中电导钙激活钾离子通道蛋白（intermediate-conduc‐tance Ca2+-activated K+channel，KCa3.1）已被证实在多种肿瘤中高表达，并在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[3-4]。但KCa3.1 在晚期LUAD 患者中的作用尚未有相关文献阐述。本研究通过检测LUAD 伴恶性胸腔积液患者胸水细胞蜡块KCa3.1 表达水平，分析其与临床特征及预后的关系，探索其促进肿瘤进展的可能机制，从而为晚期LUAD 伴恶性胸腔积液患者的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 生物信息学分析 从GEPIA 数据库获取483 例LUAD 组织和347 例正常肺组织数据，比较LUAD 组织和正常肺组织KCa3.1 表达水平。利用Kaplan-Meier plotter 数据库分析LUAD 组织KCa3.1 表达水平与肿瘤分期、总生存期（overall survival，OS）的关系。根据KCa3.1 表达水平的中位数将患者分为KCa3.1 高表达组及低表达组。

1.2 对象 选取2019 年6 月1 日至2021 年6 月30 日绍兴市人民医院收治的LUAD 伴恶性胸腔积液患者72 例，其中男27 例，女45 例；年龄43～91 岁，中位年龄69 岁。纳入标准：（1）年龄＞18 岁；（2）已行胸腔穿刺术的LUAD 患者，且其胸腔积液中找到腺癌细胞，细胞形态结合免疫细胞化学染色考虑肺来源；（3）所有患者均未接受过任何治疗，如放化疗、抗结核、抗感染、使用免疫抑制剂等。排除标准：（1）同时合并其他肿瘤；（2）不能遵守本方案研究步骤。本研究经绍兴市人民医院医学伦理委员会审查通过（批准文号：2019-K-Y-133-02），所有患者均签署知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 所有患者行胸腔穿刺术取250 ml 以上胸腔积液，静止沉淀1 h，然后吸取底部液体置入离心管中，加入10%甲醛5 ml，2 500 r/min离心5 min，去除上清液，再加入10%甲醛5 ml，2 500 r/min离心5 min，重复1 次并静置，待取材时用滤纸包裹，通过脱水、浸蜡、包埋制成细胞蜡块。

1.3.2 试剂和仪器 兔抗人KCa3.1 抗体（批号：23271-1-AP）购于美国Proteintech 公司；免疫组化3，3-二氨基苯联胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒（批号：UM-9002）和全自动免疫组化染色机（型号：Ultra PATH ZZSGB-BIO）均购于中国北京中杉金桥生物技术有限公司；显微图像分析系统（型号：DM2000）购于德国徕卡公司。

1.3.3 胸水细胞蜡块中KCa3.1 的表达情况检测 采用免疫组化En Vision 染色。将已脱水脱钙包埋好的蜡块3～5 μm 厚度连续切片，60 ℃烤片120 min，二甲苯脱蜡，梯度乙醇去二甲苯，蒸馏水水化。乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（pH 8.0）高压修复抗原，3% H2O2降低过氧化氢酶造成的非特异性背景染色，PBS 浸泡，10%山羊血清封闭20 min后，滴加兔抗人KCa3.1 抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜，以PBS 作阴性对照。37 ℃复温40 min，PBS 洗涤。滴加HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体（即用型），室温孵育30 min，PBS 洗涤后DAB 显色，显微镜下判断染色情况，蒸馏水冲洗10 min，苏木素复染，1%盐酸乙醇分化，促蓝液返蓝，脱水、透明、封片后显微图像分析系统拍照。

1.3.4 结果判定 由2 位病理医师在未知肿瘤级别的情况下进行双盲阅片。每例镜下随机采集10 个视野，观察并记录细胞染色强度，其中无染色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分；记录镜下阳性细胞百分比，其中镜下阳性细胞百分比＜5%为0 分，5%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%为4 分。细胞染色强度和镜下阳性细胞百分比计分相乘为最终得分，≤6 分为低表达，＞6 分为高表达。分析胸水细胞蜡块中KCa3.1 表达与患者临床特征的关系。

1.4 随访和生存分析 采用门诊或电话随访，末次随访时间为2022 年6 月30 日。OS 定义为患者自诊断为LUAD 开始至因任何原因引起死亡的时间。

1.5 统计学处理 采用SPSS 25.0 统计软件。LUAD组织和正常肺组织KCa3.1 表达水平比较采用两独立样本t检验。不同肿瘤分期患者KCa3.1 表达水平比较采用单因素方差分析。KCa3.1 高表达和低表达患者临床特征比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法进行生存分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析

2.1.1 LUAD 组织和正常肺组织KCa3.1 表达水平比较 生物信息学分析提示，LUAD 组织KCa3.1表达水平明显高于正常肺组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 LUAD 组织和正常肺组织KCa3.1 表达水平比较

2.1.2 不同肿瘤分期患者KCa3.1 表达水平比较 不同肿瘤分期患者KCa3.1 表达水平比较差异无统计学意义（F=0.335，P＞0.05)，见图2。

图2 不同肿瘤分期患者KCa3.1 表达水平比较

2.1.3 KCa3.1 高表达和低表达患者OS 比较 KCa3.1高表达患者OS 低于低表达患者，差异有统计学意义（P＜0.01），提示KCa3.1 高表达可能导致LUAD 的预后较差，见图3。

图3 KCa3.1 高表达和低表达患者OS 比较

2.2 临床资料分析

2.2.1 胸水细胞蜡块KCa3.1 的表达情况 免疫组化染色显示，胸水细胞蜡块中腺癌细胞的细胞质和细胞膜上均有KCa3.1 表达，见图4。图4A 中＞75%的肿瘤细胞呈现强、完整、均匀的细胞质和细胞膜染色；图4B 中＜50%的肿瘤细胞呈现不完整的、微弱的细胞质和细胞膜染色。

图4 胸水细胞蜡块中KCa3.1 的表达（A：KCa3.1 高表达；B：KCa3.1 低表达）

2.2.2 KCa3.1 高表达和低表达患者临床特征比较KCa3.1 高表达和低表达患者性别、年龄、吸烟情况、T分期、N 分期、肺外转移情况、表皮生长因子受体（epi‐dermal growth factor receptor，EGFR）基因突变情况比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 KCa3.1高表达和低表达患者临床特征比较

2.2.3 KCa3.1 高表达和低表达患者生存情况比较KCa3.1 高表达患者中位OS 为6.5 个月（95%CI：4.9～8.1个月），KCa3.1 低表达患者中位OS 为8.6 个月（95%CI：7.3～9.8 个月），两者比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 KCa3.1 高表达和低表达患者生存情况比较

3 讨论

晚期LUAD 患者往往伴有恶性胸腔积液，因其一般情况通常较差等原因可能已完全丧失手术机会，也不能耐受肺粗针穿刺或支气管镜活检等检查。胸水细胞蜡块检测具有容易获得、创伤小等优点，是病理学诊断的可选方法。相关研究发现胸水细胞蜡块和肿瘤组织检测程序性死亡受体-配体1（pro‐grammed cell death-ligand 1，PD-L1）、EGFR 基因的表达水平结果一致[5-7]，因此对于无法获得肿瘤组织样本的晚期LUAD 患者，可以通过胸水细胞蜡块检测肿瘤相关的生物学标志为肿瘤的个体化治疗和预后判断提供帮助。

KCa3.1，又称KCNN4、SK4、IKCa1，是钙激活钾离子通道家族中的一员。它由Ishii 等[8]发现，KCa3.1 基因位于第19 号染色体（19q13.2），由同源四聚体组成1个有功能的KCa3.1 蛋白，该通道在结构上拥有6个跨膜区域（S1～S6），S5 与S6 中间有一段内陷的疏水序列形成通透离子的孔道，其中高度保守的“GYG”氨基酸标志性序列对K+有较高的选择性，该通道蛋白的C-末端连接钙调蛋白，为该通道对钙敏感性调节的重要结构，感应细胞内Ca2+浓度并进行调控[9]。KCa3.1 表达于哺乳动物的各个器官组织，如脑、心、肺、胃肠道、前列腺、子宫、乳腺、造血组织等，参与调节侵袭、转移、细胞周期进程、氧耗氧代谢、DNA 损伤反应和细胞死亡等多种细胞过程，因此在体内的组织纤维化、细胞增生、内外分泌腺的分泌等过程中发挥重要作用[10]。目前已有研究发现KCa3.1 在多种肿瘤如结直肠癌[11]、胰腺癌[12]等中呈现高表达。本实验通过公共数据库GE‐PIA 对KCa3.1 基因在LUAD 中的表达情况进行分析发现LUAD 患者KCa3.1 表达水平明显高于正常肺组织，并通过免疫组化法检测到绍兴市人民医院LUAD 伴恶性胸腔积液患者胸水细胞蜡块细胞质和细胞膜上均有KCa3.1 的表达，提示KCa3.1 可能对LUAD 的发生、发展有促进作用。

Kaplan-Meier plotter 数据库分析发现KCa3.1 高表达患者OS 低于低表达患者。但是该数据库对LUAD的分析主要针对早中期可手术患者，对晚期患者的数据相对较少。本研究以LUAD 伴恶性胸腔积液的患者为研究对象，对其进行生存分析，结果发现KCa3.1 高表达的LUAD 患者预后不佳，与公共数据库的结果一致。目前在其他癌症中已发表的相关研究结果也提示KCa3.1 高表达与肿瘤不良预后有关。Du 等[12]在胰腺导管腺癌患者中发现高表达KCa3.1 与较差的总体生存率显著相关。Li 等[13]发现肝细胞癌组织中具有高KCa3.1 表达的患者表现出较短的无病生存期。Chen等[14]通过综合生物信息学分析筛选和鉴定黑色素瘤的潜在生物标志物，发现KCa3.1 与CDH3、ESRP1、FGF2、GBP2、KIT、SEMA4D 和ZEB1 一起作为枢纽基因，被认为与黑色素瘤的不良预后密切相关。Chen 等[15]发现KCa3.1 在肾透明细胞癌组织中高度表达，且与患者的预后呈负相关，并推测KCa3.1 可能通过影响肿瘤免疫微环境来影响肾透明细胞癌预后。由此可见，KCa3.1可能是肿瘤预后不良因素，可作为LUAD 预后相关的潜在生物标志物。

综上所述，本研究发现LUAD 患者KCa3.1 表达水平明显增高，其中高表达患者OS 相对较低，提示KCa3.1 可能是影响LUAD 预后的危险因素，并为LUAD患者的诊断和预后判断提供了一个潜在靶点。但由于本实验纳入样本量较少，研究结论仍需进一步验证，对其具体作用机制也有待进一步探讨。