基于NF-κB信号通路探究大黄酸对肺泡上皮细胞损伤的保护作用

赵宁生 胡勇 郑玲

急性肺损伤是由多种致病因素引发的一种严重的炎症反应综合征[1]，临床上表现为呼吸困难、血液低氧、皮肤黏膜发绀、呼吸频率增加等症状，发展到严重阶段可引发急性呼吸窘迫综合征[2]。目前临床上治疗手段以药物和辅助呼吸治疗为主。传统中医药在其中凸显出了独特优势，受到了越来越多的关注。中医学将急性肺损伤归为邪毒入侵导致的痰饮淤积，治疗以祛邪兼扶正的方法[3]。中药大黄属于蓼科大黄属的多年生植物，具有泻下攻积、清利湿热、凉血解毒、祛瘀等功效[4]。大黄酸是大黄的主要有效成分，有抗菌、抗炎、治疗糖尿病和肾病等作用[5]。近年来研究发现，大黄酸对改善肺损伤具有一定的积极作用[6]。NF-κB信号通路是与炎症相关的经典通路之一，具有调节机体炎性反应的作用[7]。有研究报道抑制NF-κB 信号通路对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的急性肺损伤具有保护作用[8]。LPS 是由脂质和多糖组成的内毒素，研究发现LPS 能够引起肺泡上皮细胞损伤并诱导其发生炎性反应[9]。因此本研究选择LPS 诱导人肺泡上皮A549 细胞作为急性肺损伤细胞模型，探讨大黄酸对LPS 诱导的炎症损伤肺泡上皮细胞增殖和迁移的影响以及NF-κB 信号通路的作用，为大黄酸应用于急性肺损伤的相关研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株 人肺泡上皮细胞A549 购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.2 药品、试剂与仪器 大黄酸（批号：T06J10F92311）、NF- κB 信号通路抑制剂BAY 11-7082（批号：J07HS173399）和LPS（批号：J07HS174755）均购自上海源叶生物科技有限公司；NF-κB 信号通路激活剂佛波酯（phorbol 12- myristate 13- acetate，PMA）（批号：0000112801）购自美国Sigma-Aldrich 公司；FBS（批号：2176404）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；F-12K 培养基（批号：20220617）购自北京索莱宝生物科技有限公司；RIPA 裂解液（批号：051322220531）、5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）细胞增殖检测试剂盒（批号：2321220429）均购自上海碧云天生物科技有限公司；IL-6 ELISA 检测试剂盒（批号：Feb2022/Mar2022）、IL-1β ELISA 检测试剂盒（批号：Mar2022）均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；细胞计数试剂盒-8（cell count kit-8，CCK-8）（批号：C6205060）购自上海翌圣生物科技有限公司；鼠抗人磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）（批号：09）购自美国CST 公司；鼠抗人[NF-κB p65（批号：10021394）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteine aspartic protease-1，Caspase-1）（批号：10004552）、细胞周期素D1（Cy‐clin D1）（批号：10016419）、β-actin（批号：10021787）]及辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（批号：20000374）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；MCO18AIC 型二氧化碳培养箱购自日本三洋电机公司；XSP-63XDV 型光学倒置显微镜购自上海光学仪器一厂；FlexStation 3 型多功能酶标仪购自美国Molecular Devices 公司；FluorChem HD2 型凝胶成像系统购自美国Proteinsimple 公司等。

1.3 方法

1.3.1 A549 细胞培养 将A549 细胞培养于F-12K 培养基（含10% FBS、1%青-链霉素）中，待细胞贴壁后密度达80%以上时进行细胞传代，取第3 代对数生长期的A549 细胞用于实验，环境条件维持37 ℃，5% CO2。

1.3.2 分组及干预 体外培养A549 细胞分为对照组（不做干预）、模型组（以10 μg/ml LPS 刺激A549 细胞24 h 构建体外急性肺损伤细胞模型[10]），LPS+2、4、8 μmol/L 大黄酸组（在模型组的基础上分别加入2、4、8 μmol/L 大黄酸进行药物干预），采用ELISA 法测定炎症因子IL-6、IL-1β 的表达水平，CCK-8 法测定细胞活力，筛选出炎症因子和细胞活力与模型组比较均显著变化的最小大黄酸浓度（2 μmol/L）进行后续实验。随后将细胞分为对照组、模型组、大黄酸组、BAY 11-7082 组、抑制剂组和激活剂组。其中对照组不做干预，模型组以10 μg/ml LPS 进行干预，大黄酸组在模型组的基础上加2 μmol/L 大黄酸进行干预，BAY 11-7082 组在模型组的基础上加5 μmol/L BAY 11-7082 进行干预[11]，抑制剂组在大黄酸组的基础上加5 μmol/L BAY 11-7082 进行干预，激活剂组在大黄酸组的基础上加1 μmol/L PMA 进行干预[12]，后置于37 ℃，5% CO2条件下培养24 h。

1.3.3 A549 细胞中IL-6、IL-1β 水平检测 采用ELI‐SA 法。收集药物干预24 h 后的细胞，利用超声对细胞进行破碎，离心后吸取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书操作步骤，测定IL-6、IL-1β 水平。

1.3.4 A549 细胞活力检测 采用CCK-8 法。取LPS干预24 h 的细胞，调整密度至2×105个/ml，将其接种到96 孔板中，每孔加细胞悬液100 μl ，实验重复3次。药物干预24 h 后，加入CCK-8 溶液10 μl 孵育2 h后，使用酶标仪测定各组450 nm 波长处吸光度（opti‐cal density，OD）值，每组检测3 次。细胞活力（%）=OD（模型组或10 μg/ml LPS+2、4、8 μmol/L 大黄酸组-空白组）/OD（对照组-空白组）×100%。

1.3.5 A549 细胞增殖率检测 采用EdU 法。取各药物干预24 h 的细胞，进行EdU 处理，去除培养液，加入4%多聚甲醛0.5 ml 处理15 min，用0.5 ml 3% BSA 洗涤，重复3 次，接着用0.5 ml 0.3% TritonX-100 去除残留的BSA，室温下处理10 min，再进行3 次洗涤；使用12 孔板，每孔加入200 μl Click 反应液后室温下避光孵育30 min，洗涤3 次；加入Hoechst 处理10 min，再进行3 次洗涤后装片，使用荧光显微镜拍照，使用Image J图像分析软件对图片进行处理。EdU 阳性染色细胞（红色）占总细胞（蓝色）的百分比表示细胞增殖率。

1.3.6 A549 细胞迁移数检测 采用Transwell 小室法。细胞分组与给药方法同1.3.2，用无血清培养基将各组细胞制成细胞悬液，调整密度为3×105个/ml，取Transwell 小室，在上室中加入0.2 ml 细胞悬液，下室加入0.5 ml 含10% FBS 的培养基。24 h 后，弃上清液，擦去上室细胞，用4%多聚甲醛固定20 min 后晾干，0.1%结晶紫染色10 min，PBS 清洗3 次，晾干。将Transwell小室置于显微镜上，每孔随机选5 个不同区域，用显微镜观察拍照。每孔随机选5 个不同区域。使用Image J图像分析软件计算细胞迁移数。

1.3.7 A549 细胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Cas‐pase-1 和Cyclin D1 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。收集药物干预24 h 的细胞，提取蛋白并进行定量后上样，跑电泳后转膜，封闭2 h，参照抗体说明书加入相应一抗（NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-1、Cyclin D1 及β-actin），4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤后加入山羊抗鼠IgG 二抗，孵育2 h，洗涤3 次，最后加入显影液，使用凝胶成像系统拍照记录。蛋白灰度值用G表示，蛋白相对表达量=G目的蛋白/G内参蛋白（β-actin）。

1.4 统计学处理 采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄酸干预LPS 诱导的A549 细胞的作用浓度筛选 与对照组相比，模型组细胞IL-6、IL-1β 水平均升高（均P＜0.05），而细胞活力降低（P＜0.05）。与模型组相比，LPS+2、4、8 μmol/L 大黄酸组细胞IL-6、IL-1β 水平均降低（均P＜0.05），而细胞活力均升高（均P＜0.05）。因此本研究在模型组基础上，选择炎症因子水平和细胞活力均有显著差异且浓度较低的LPS+2 μmol/L 大黄酸作为大黄酸组，再分别加入NF-κB 信号通路抑制剂BAY 11-7082 和激活剂PMA进行NF-κB 信号通路验证实验，见图1、2。

图1 各组细胞炎症因子IL-6、IL-1β 水平比较

图2 各组细胞活力比较

2.2 各组细胞增殖率比较 与对照组相比，模型组细胞增殖率降低（P＜0.05）。与模型组相比，大黄酸组和BAY 11-7082 组细胞增殖率均升高（均P＜0.05）。与大黄酸组相比，抑制剂组细胞增殖率进一步升高（P＜0.05），激活剂组细胞增殖率降低（P＜0.05），见图3（插页）。

图3 各组细胞增殖率比较（A：各组细胞EdU 增殖图，×200；B：各组细胞增殖率比较；与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与大黄酸组相比，cP＜0.05）

2.3 各组细胞迁移数比较 与对照组相比，模型组细胞迁移数升高（P＜0.05）。与模型组相比，大黄酸组和BAY 11-7082 组细胞迁移数均降低（P＜0.05）。与大黄酸组相比，抑制剂组细胞迁移数进一步降低（P＜0.05），激活剂组细胞迁移数升高（P＜0.05），见图4（插页）。

图4 各组细胞迁移数比较（A：各组细胞迁移图，0.1%结晶紫染色，×200；B：各组细胞迁移数比较；与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与大黄酸组相比，cP＜0.05）

2.4 各组细胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-1和Cyclin D1 蛋白表达水平比较 与对照组相比，模型组细胞Cyclin D1 蛋白表达水平降低（P＜0.05），而Caspase-1、p-NF-κB p65 蛋白表达水平均升高（均P＜0.05）。与模型组相比，大黄酸组和BAY 11-7082 组细胞Cyclin D1 蛋白表达水平均升高（均P＜0.05），而Caspase-1、p-NF-κB p65 蛋白表达水平均降低（均P＜0.05）。与大黄酸组相比，抑制剂组细胞Cyclin D1 蛋白表达水平升高（P＜0.05），Caspase-1、p-NF-κB p65 蛋白表达水平均降低（均P＜0.05），激活剂组细胞Cyclin D1 蛋白表达水平降低（P＜0.05），而Caspase-1、p-NFκB p65 蛋白表达水平均升高（均P＜0.05）。各组细胞中NF-κB p65 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图5。

图5 各组细胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-1 和Cyclin D1 蛋白表达水平比较（A：各组细胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、Cas‐pase-1 和Cyclin D1 蛋白表达的电泳图；B：各组细胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-1 和Cyclin D1 蛋白表达水平比较；与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与大黄酸组相比，cP＜0.05）

3 讨论

急性肺损伤会诱导过度炎症反应现象，加速炎症细胞因子释放及损伤肺上皮细胞及内皮细胞[13]。因此，对过度的炎症反应进行阻遏可能会有效预防和治疗急性肺损伤[14]。但目前对于急性肺损伤的治疗仍缺乏低毒有效的手段。而传统中医药因其毒副反应小、疗效显著等优势受到了越来越多的关注。中医认为热毒、湿热、痰热和瘀血等发病因素的相互作用是引发急性肺损伤的主要因素，所以治疗上通常以清热解毒、祛痰化瘀等方法[15]。

大黄酸是一种天然的蒽醌衍生物，主要提取自大黄及虎杖等中草药，具有较好的抗肿瘤、抗菌、抗炎及抗病毒活性[16]。众多文献表明，大黄及其提取物大黄酸对急性肺损伤具有保护作用。汪普求[17]研究发现，大黄素与大黄酸联合对百草枯中毒的大鼠肺损伤具有保护作用。蒋欢欢等[18]通过临床试验证明鼻饲大黄辅助治疗可有效降低急性肺损伤患者炎症因子水平，促进呼吸功能及血气指标恢复，缩短病情改善周期，防止病情进展恶化。而LPS 是引起肺部炎症导致急性肺损伤的重要原因之一[19]。因此，本研究通过LPS 诱导人肺泡上皮细胞A549 建立体外模型，探讨大黄酸对A549 细胞的影响，结果发现，与对照组相比，模型组LPS 诱导A549 细胞后，炎症因子IL-6、IL-1β 水平均升高，且细胞活力降低。而在2、4、8 μmol/L 大黄酸处理LPS 诱导的A549 细胞后，细胞活力明显得到恢复，炎症因子IL-6、IL-1β 水平显著降低，说明大黄酸能够促进LPS 诱导的A549 细胞活力，抑制炎症因子水平。本研究选择有显著差异且较低浓度的大黄酸（2 μmol/L）进行后续实验。与对照组相比，模型组细胞增殖率、Cyclin D1 蛋白表达水平均降低，细胞迁移数、Caspase-1、p-NF-κB p65 蛋白表达水平均升高，大黄酸组扭转了LPS 对A549 细胞的作用。以上结果说明大黄酸可以减轻LPS 诱导的A549 细胞炎症损伤。

NF-κB 信号通路是与炎症相关的经典通路之一，近年来研究表明抑制NF-κB 信号通路能够降低急性肺损伤的炎症水平，发挥抗炎作用[20]。研究证明抑制NF-κB 信号通路可减轻LPS 诱导的急性肺损伤，并对其发挥保护作用[21]。王瑞哲等[22]研究认为当下调炎症信号通路NF-κB 时，可减少促炎因子TNF-α、IL-6 释放，调节炎症反应进程，产生抗炎免疫环境，从而达到治疗急性肺损伤的目的。但是关于大黄酸对LPS 诱导的A549 细胞中NF-κB 通路的调控作用未见报道，因此本研究以此为切入点进行了实验，结果显示，LPS 处理A549 细胞后，p-NF-κB p65 蛋白表达水平升高。经大黄酸和BAY 11-7082 分别再次处理后，p-NF-κB p65 蛋白表达水平均降低，表明大黄酸和NF-κB 通路抑制剂BAY 11-7082 可能抑制了NF-κB 通路的信号转导。而后在大黄酸的基础上分别加入NF-κB 信号通路抑制剂和激活剂进行通路验证实验，发现BAY 11-7082 增强了大黄酸对LPS 诱导细胞增殖率和Cy‐clin D1 蛋白表达水平的促进作用及细胞迁移数、Cas‐pase-1、p-NF-κB p65 蛋白表达水平的抑制作用，PMA则削弱大黄酸对细胞的这种作用，这些结果说明大黄酸可能是通过抑制NF-κB 信号通路的活化而保护LPS 诱导A549 细胞的损伤，促进细胞增殖、抑制细胞迁移的。

综上所述，大黄酸对A549 细胞炎症损伤具有保护作用，并促进细胞增殖和抑制细胞迁移，其作用机制可能与抑制NF-κB 信号通路有关。但大黄酸是否通过其他机制减轻对LPS 诱导的急性肺损伤尚不明确，后续将进一步深入探究，以期为大黄酸应用于急性肺损伤的药物研发提供理论依据。