根皮素-4,4'-联吡啶共晶的制备表征与溶解性能测定*

张雷,张丹丹,尚会建,陈旭

(河北科技大学化学与制药工程学院,石家庄 050000)

根皮素(phloretin,PHL)是一种二氢查尔酮类天然产物,广泛存在于苹果、梨和其他多汁水果的果皮和果树根皮中[1-2]。根皮素具有抗氧化、抗自由基、抗炎、抗肿瘤等生物和药理活性[3-4],应用于面膜、护肤膏霜、乳液和精华素等护肤品中[5-6]。由于水溶性差和生物利用度低,导致根皮素的应用受到诸多限制。临床上,因根皮素在水中溶解度仅0.02 mg·mL-1,导致其治疗效果难以发挥[7-8]。目前,为提高根皮素溶解度以适应临床需求,需要研究新制剂来改良根皮素理化性质[9-12],其中共晶因具有不破坏药物活性成分以及更加稳定的特性而受到关注[13]。

药物共晶是指活性药物成分(active pharmaceutical ingredient,API)和共晶形成物(cocrystal former,CCF)之间通过氢键、卤键等非共价键相互作用而堆积形成的超分子化合物[14-15]。空间堆积方式的改变导致药物活性分子在形成共晶后的物理性质发生部分变化,可改变药物溶出[16]、溶解[17-19]、稳定性[20-21]、生物利用度[22]、可压缩性等重要参数。

目前已有文献报道了几种以根皮素为API的共晶,如根皮素-烟酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ晶型[23],根皮素-异烟酰胺[24],根皮素-甜菜碱[25]等共晶。研究表明,根皮素的某些共晶可在一定程度上增加根皮素平衡溶解度,并具有较好的溶解性能。笔者在本实验对合成根皮素新共晶进行研究,通过液体辅助研磨法、浆式结晶法及蒸发结晶法制备根皮素-4,4'-联吡啶(4,4'-Bipyridine,BPY)共晶,以期增加根皮素溶解性能,提高根皮素生物利用度。

1 材料与方法

1.1仪器 粉末X-射线衍射仪(powder X-ray diffraction,PXRD):Rigaku D/max-2550,日本理学Rigaku公司。测试条件:电源设置40 kV、40 mA,Cu/Kα(λ=0.154 nm)射线源,扫描步长0.02 °,速度5 °·min-1,范围5°～40°(2θ)[11]。热重分析-差示扫描量热仪(thermogravimetric analysis-differential scanning calorimetry,TG-DSC):STA 449 F5,德国NETZSCH公司。分析条件:氮气流量50 mL·min-1,30～350 ℃下升温10 ℃·min-1。傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR):Spectrum 400,美国PerkinElmer公司。元素分析(elemental analysis,EA):Vario EL Cube CHNS,德国Elemenlar公司。高效液相色谱(HPLC)仪:Agilent 1200,美国Agilent公司。检测条件:Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 mm)。流动相:甲醇-0.4%磷酸盐溶液(70：30)。溶出实验仪:RC12AD配RZQ-12D取样收集系统,天大天发有限公司。药品稳定性实验箱:DAA-1型,上海一恒科学仪器有限公司。

1.2试药 根皮素(含量≥98.0%,批号:C14294776)、4,4'-联吡啶(含量≥98.0%,批号:C13166696)由上海麦克林生化科技有限公司提供;丙酮(分析纯,批号:20171125)由天津博迪化工股份有限公司提供;甲醇(色谱纯,批号:20180808)、乙腈(色谱纯,批号:20180208)、磷酸(分析纯,批号:20170402)、无水乙醇(分析纯,批号:20170918)由天津市大茂化学试剂厂提供;所有实验用水均为超纯水。

1.3实验方法 准确称取根皮素549 mg和4,4'-联吡啶312 mg(物质的量之比为1：1),置研钵中,缓慢加入无水乙醇0.25 mL,室温(25 ℃)研磨30 min;或准确称取根皮素549 mg和4,4'-联吡啶312 mg(物质的量之比为1：1),置洁净锥形瓶,加适量无水乙醇于室温(25 ℃)磁力搅拌12 h。过滤取滤饼,50 ℃条件下真空干燥24 h得白色粉末即为BPY共晶;或准确称取根皮素549 mg和4,4'-联吡啶312 mg(物质的量之比为1：1),置干净西林瓶,加无水乙醇4 mL和丙酮1 mL至溶质全部溶解,封口膜封口,针扎3～5个小孔,置25 ℃洁净环境中缓慢挥发,48 h后长出针状白色晶体,即为BPY共晶。

1.4分析方法 溶出性能评价:取PHL-BPY共晶、物理混合物和根皮素适量,经孔径150 μm(100目)药筛筛分,取根皮素30 mg当量3种物质,分别加入溶出介质(水、pH值1.2盐酸和pH值6.8磷酸盐缓冲液)450 mL并置溶出实验仪,设置温度37 ℃,搅拌转速100 r·min-1,300 min内间隔取样用HPLC分析。以3000 min(50 h)的平衡浓度作为实验的平衡溶解度。实验结束后取各自残留固体经过滤、干燥并测定PXRD。

稳定性评价方法:于培养皿中放置BPY共晶产物样品100 mg,置(50±1) ℃下分别在0,10,30,60 d后取样;高湿稳定性实验测试条件:置25 ℃下相对湿度(75±5)%恒湿密闭容器,分别在0,10,30,60 d后取样。PXRD分析样品稳定性。

2 结果

2.1PXRD分析结果 在PXRD谱图中,新晶相形成会改变衍射峰形状、强度及位置,因此可用于判断共晶是否形成[26-27]。使用Origin软件分析衍射图,结果见图1。

a:根皮素;b:4,4'-联吡啶;c:液体辅助研磨结晶;d:浆式结晶;e:蒸发结晶。

图1为制备的共晶产物与原料的PXRD谱图对比。由图1可知,研磨结晶、浆式结晶和蒸发结晶3种制备方法得到共晶产物的PXRD图基本一致,可以认为得到的为一种共晶,下文将3种制备方法得到的共晶统称为共晶产物。共晶产物PXRD谱图与根皮素、4,4'-联吡啶的PXRD谱图不同,原本归属于根皮素的6.93°,9.51°,16.52°,27.12°等位置特征峰,以及归属于4,4'-联吡啶的10.16°,12.59°,17.80°,25.90°,27.98°等位置特征峰消失,而共晶产物在6.59°,11.82°,14.01°,19.26°,20.06°,23.90°等位置出现了不同于根皮素和4,4'-联吡啶的新衍射峰。共晶产物PXRD谱图中有新衍射峰出现,证明有新晶相生成。且共晶产物中根皮素、4,4'-联吡啶原料药部分特征峰完全消失,说明共晶产物纯度较高。

2.2TG-DSC分析结果 通过TG-DSC分析物质熔点及热失重过程。从DSC曲线可知原料药及产物熔点变化[28-29],从TG曲线中可以看出原料药及产物的热分解过程[30],若有新的熔点出现以及不同的热分解过程则可进一步判断是否形成共晶[31-32]。对DSC、TG数据结果分别分析。

本实验所制备的共晶产物与原料的DSC谱图见图2,可知,根皮素在266.83 ℃处出现一个吸热峰,与其熔点(267 ℃)一致。4,4'-联吡啶在112.84 ℃处出现一个吸热峰(195.30 ℃为4,4'-联吡啶分解温度),与其熔点(112.15 ℃)一致。共晶产物在222.36 ℃有一个吸热峰,推测为其熔点。其中共晶产物的熔点与根皮素和4,4'-联吡啶熔点均不相同。通常,共晶熔点介于API与CCF之间,产物符合这一特点,可作为判定新物相属于共晶的一个佐证。

图2 共晶产物与原料DSC谱图

共晶产物与原料的TG谱图见图3。共晶产物的分解失重温度(175 ℃)低于根皮素的分解失重温度(257 ℃),高于4,4'-联吡啶分解失重温度(111 ℃)。并且在分解失重之前未见明显失重,证明无结晶水或结晶溶剂存在。失重温度不同说明共晶产物与原料热稳定性不同,这与DSC分析结果一致。

2.3FT-IR结果 通过FT-IR可以判断API与CCF之间是否形成新的非共价键[33-34]。对根皮素、4,4'-联吡啶以及共晶产物进行FT-IR分析,以检测根皮素与4,4'-联吡啶之间的相互作用以及晶体结构的更多细节。

图3 共晶产物与原料TG谱图

结果见图4,BPY共晶在3030,1620,1596,1534,802,730 cm-1产生红外吸收峰,其中3030 cm-1为不饱和碳的νC-H吸收峰,1620 cm-1为根皮素中νC=O吸收峰,1596和1534 cm-1为νC=C和νC=N吸收峰,802和730 cm-1为芳香环吸收峰。由图4可知,根皮素与4,4'-联吡啶共同组成共晶。比较BPY共晶与根皮素、4,4'-联吡啶FT-IR图谱,在νO-H(2800～3600 cm-1)官能团特征区处,共晶的FT-IR图谱发生了变化,在形成共晶时不饱和碳的νC-H与根皮素中νO-H=3275 cm-1形成吸收峰共同红移至3030 cm-1,推测为4,4'-联吡啶中两端的N原子与根皮素中的O-H形成的氢键,因此可以推断根皮素与4,4'-联吡啶形成共晶的方式为C=N…H-O的相互作用。这进一步验证了根皮素、4,4'-联吡啶形成了BPY共晶。

图4 共晶产物与原料FT-IR谱图

2.4EA结果 通过EA可以测定产物中元素的质量分数,从而确定共晶的化学计量比。通过使用元素分析仪将实验样品氧化燃烧,测定产生的3种氧化燃烧生成产物二氧化碳(CO2)、水(H2O)和氮气(N2)的质量,来确定碳(C)、氢(H)、氮(N)3种元素的含量,通过扣除确定的N、C、H元素可得O元素含量[35]。

结果见表1,BPY中各元素含量符合化学计量比根皮素：4,4'-联吡啶为1：1的元素含量,所以BPY中根皮素与4,4'-联吡啶化学计量比为1：1,即1 mol根皮素可与1 mol 4,4'-联吡啶形成共晶。

表1 BPY共晶各元素含量

2.5HPLC分析 HPLC图见图5。根皮素保留时间为4.01 min,其杂峰对根皮素测定无干扰。

图5 根皮素HPLC谱图

2.6粉末溶出曲线与平衡溶解度 药物在水性介质中的溶解速度很大程度上决定了药物生物利用度和功效。2020年版《中华人民共和国药典》四部通则中0931溶出度与释放度测定法,实验采用其中搅拌桨法进行测定。

药物的粉末溶出速率和平衡溶解度是影响其生物制药性能的关键参数。对根皮素、物理混合物以及共晶产物在水、pH值1.2盐酸、pH值6.8磷酸盐缓冲溶液3种溶出介质中的粉末溶出度和平衡溶解度进行研究。根皮素、物理混合物以及共晶产物的粉末溶解曲线和平衡溶解度值分别见图6-8。其中图6为根皮素、物理混合物和共晶产物在水、pH值1.2和pH值6.8溶液中0～300 min内溶出度曲线。共晶产物、物理混合物和根皮素在3种溶液中均可快速溶解。在pH值1.2和pH值6.8溶液中,共晶产物在初始快速释放后可以保持稳定。而在水中共晶产物在初期快速释放后可以观察到浓度快速上升和下降(“弹簧”效应),可以归因于相应的根皮素形成了低溶性固体。

a:水;b:盐酸溶液(pH值=1.2);c:磷酸盐缓冲溶液(pH值=6.8)。

a:水;b:盐酸溶液(pH值=1.2);c:磷酸盐缓冲溶液(pH值=6.8)。

图8 根皮素、物理混合物和共晶产物在水、盐酸溶液(pH值=1.2)、磷酸盐缓冲溶液(pH值=6.8)中的平衡溶解度

图7为根皮素、物理混合物和共晶产物在水、pH值1.2和pH值6.8溶液中300～3000 min内溶出度曲线。由图可知,无论是根皮素、物理混合物还是共晶产物,其过饱和度即使在3000 min后仍能保持不变,这种过饱和根皮素的“悬停”现象可能与根皮素与4,4'-联吡啶络合有关。

由图8可知,共晶体在水、pH值1.2和pH值6.8的3种溶液平衡溶解度分别为根皮素原料药的1.20,1.60和1.12倍,分别为物理混合物的1.11,1.43和1.08倍,共晶产物平衡溶解度较根皮素原料药、物理混合物均有相应提高。

BPY共晶在不同溶剂中的溶出机制,可以通过溶出曲线及溶解后剩余固体PXRD图谱(图9)观察。共晶产物在水溶液中的溶解原理,可以解释为共晶在溶解过程中氢键会瞬间打开,导致共晶配体4,4'-联吡啶溶解于水,这时难溶的根皮素会因为共晶结构的突然坍塌而形成无定型态,使根皮素溶解度产生一个峰值,即为“弹跳”现象,随后根皮素又转变为稳定的低溶解性晶体,所以会导致根皮素的浓度下降,即“伞降”现象,因此BPY共晶在水溶液中的溶解机制与“弹跳-伞降”模型吻合。对于BPY共晶在pH值1.2的盐酸溶液和pH值6.8的磷酸盐缓冲溶液这两种溶出介质中,通过共晶溶解后残留固体的PXRD图谱以及溶出曲线可以猜想出共晶产物在整个溶解过程中一直以共晶形式存在,共晶中的氢键并没有被打开,这与共晶产物在这两种溶液中的溶出曲线并未出现“弹跳-伞降”现象一致。

a:根皮素;b:4,4'-联吡啶;c:共晶产物;d:水溶解后;e:pH值1.2盐酸溶解后;f:pH值6.8磷酸盐缓冲溶液溶解后。

2.7稳定性实验结果 稳定性研究表明,实验得到的BPY共晶样品不易降解,见图10—11,BPY共晶在高温[(60±1) ℃]和高湿[温度25℃,相对湿度(75±5)%]条件下的PXRD图谱均无显著变化,表明上述样品在高温、高湿条件下均保持稳定。产品适合工业化应用、长期储存及制备成口服固体制剂。

图10 BPY共晶在高温[(50±1)℃]条件下不同时间的PXRD图谱

图11 BPY共晶在高湿[温度25 ℃、相对湿度(75±5)%]条件下不同时间的PXRD图谱

3 讨论

笔者在本实验采用液体辅助研磨法、浆式结晶法以及蒸发结晶法制备新的BPY共晶,并采用PXRD、TG-DSC联用、FT-IR、EA等方法进行了晶体结构表征,确定了该产物为共晶产物。同时对共晶产物进行了溶出速率、平衡溶解度以及稳定性考察,实验结果表明,与物理混合物和单独根皮素原料相比,共晶可以提高根皮素的溶解性能,并且具有较好的溶解性能。稳定性实验表明,BPY共晶在高温[(50±1) ℃]和高湿(温度25 ℃,相对湿度75%)条件下分别具有良好的化学稳定性。本研究为提高难溶性药物溶出速率及溶解性提供了理论及技术支持,具有较好的应用前景。