索拉非尼无定形体系结晶动力学稳定性评价及结晶抑制剂筛选*

孙嘉汝,田雅雯,董雪晴,李元春,闫承业,杨彩琴

(河北医科大学药学院,石家庄 050017)

索拉非尼较差的水溶性导致其口服生物利用度低,限制了其临床应用[1]。增大给药剂量可提高治疗效果,但会导致严重的副作用及药物毒性,通过增加溶解度来改善其生物利用度显得至关重要。过饱和药物递送系统吸引了众多研发人员的关注,其改善生物利用度的过程通常可用“弹簧-降落伞”理论描述[2]:当高能态药物暴露于给药环境中时,快速产生过饱和溶液,称为“弹簧”;“降落伞”效应则是指使用聚合物或表面活性剂等在足够的时间内维持药物处于过饱和状态[3],从而增加药物在胃肠道的溶出,达到促进药物吸收以提高生物利用度的效果。将药物无定形化是过饱和递送系统常用方式,无定形技术可将分子间有序堆积的晶态药物转化为无序排列的无定形态药物,使药物具有更高的表面自由能,在溶液中极速溶解、快速释放达到过饱和状态[4],从而提高药物在人体内的生物利用度。但无定形药物在溶解、吸收加工等过程中有自发结晶的趋势,易丧失溶解度和溶出度优势,该特性是制约无定形药物发展的瓶颈。笔者在本研究中制备索拉非尼无定形体系,探索其动力学稳定性和聚合物抑制结晶效应,以期为进一步开发及生产应用索拉非尼无定形药物提供参考。

1 材料与方法

1.1药品及试剂 索拉非尼游离碱(郑州阿尔法化工有限公司,含量:99%,批号:284461-73-0);聚乙烯醇1788(阿拉丁生化科技股份有限公司,批号:A1231003);甲基纤维素M450(天津博迪化工股份有限公司,批号:20190806);羟丙甲基纤维素k15(上海卡乐康包衣技术有限公司,批号:PDR455918);低取代羟丙纤维素(南京化学试剂有限股份公司,批号:20180319);泊洛沙姆188(上海昌为医药辅料技术有限公司,批号:20200522);聚乙烯吡咯烷酮k30(阿拉丁生化科技股份有限公司,批号:E2117238);聚山梨酯80(天津市富宇精细化工有限公司,批号:20170522);磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(天津市光复科技发展有限公司,批号分别为20210101,20200927)。

1.2实验仪器 旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司,型号:N-1100);差示扫描量热(differential scanning calorimetry,DSC)分析仪(德国耐驰仪器制造有限公司,型号:DSC214);粉末X射线衍射(powder X-ray diffraction,PXRD)仪(美国Rigaku公司,型号:SmartLAbSE);双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);恒温空气摇床(上海南荣实验室设备有限公司,型号:NRY-200);溶出实验仪(天津市天大天发科技有限公司,型号:RC808D);YB-2型澄明度检测仪(天津大学精密仪器厂);恒温恒湿实验箱(德国宾德公司,型号:16-18793)。

1.3无定形的制备 将索拉非尼原料药120 mg溶于甲醇40 mL,在水浴60 ℃、转速50 r·min-1的旋转蒸发仪中反应1 h,在30 ℃、50 r·min-1条件下减压除去溶剂,真空干燥12 h,备用。

1.4PXRD测试条件 铜靶,电压40 kV,电流50 mA,扫描速率10 °·min-1,扫描范围5～40 °,步长0.02 °。

1.5温度调制差示扫描量热(temperature modulated differential scanning calorimetry,TMDSC)分析条件 取样品6 mg,温度范围20～120 ℃,升温速率2 K·min-1,振幅0.5 K,周期60 s,氮气流速40 mL·min-1。

1.6DSC分析条件 样品6 mg,温度范围40～240 ℃,升温速率2,10,20,30,40 K·min-1,氮气流速40 mL·min-1。

1.7影响因素实验 将样品置于敞口称量瓶,摊成厚度≤5 mm薄层,高温实验条件为55 ℃,高湿度实验条件为25 ℃、相对湿度为92.5%,强光照射试验照度(4000±500) lx。分别于0,5,10 d取样,考察药物外观性状,测定药物质量及含量变化,实验平行3份。

1.8加速实验 将样品平铺于敞口称量瓶,置40 ℃、相对湿度75%恒温恒湿箱环境内,考察稳定性。

1.9溶解度测定

1.9.1含量测定方法 以含0.1% 聚山梨酯80的0.02 mol·L-1pH值7.40磷酸盐缓冲液为溶剂(以下简称溶剂)配制一系列索拉非尼和聚合物溶液,确定检测波长,绘制标准曲线,考察日内精密度、日间精密度、方法回收率、稳定性与定量限。

1.9.2聚合物类型筛选 将过量无定形样品分别加入20 mL预溶有50 μg·mL-1的甲基纤维素M450、羟丙甲基纤维素k15、低取代羟丙纤维素、聚乙烯吡咯烷酮k30、聚乙烯醇1788、泊洛沙姆188的溶剂,置空气摇床内,37 ℃、100 r·min-1振荡36 h达平衡,孔径0.45 μm微孔滤膜过滤,测定吸光度,计算溶解度,平行3份,以未加聚合物的晶态、无定形态药物为对照。

1.9.3聚合物用量的筛选 将过量无定形样品分别加至20 mL预溶有12.5,25,50,100,200 μg·mL-1甲基纤维素M450的溶剂,在“1.9.2”项条件下测定吸光度,计算溶解度,平行3份。实验结束后,收集残余固体,烘干,进行PXRD表征。

1.10粉末体外溶出实验测定 参照《中华人民共和国药典》2020年版规定的溶出度测定法第二法“桨法”[5]测定。精密称定无定形样品20.00 mg,以预溶50 μg·mL-1甲基纤维素M450的溶剂500 mL为溶出介质,在(37±0.5)℃、100 r·min-1条件下进行实验,在3,5,10,15,20,30,45,60,90,120,150,240 min时间点取样,取样后立即补充相同体积温度溶出介质,测定吸光度,计算累积溶出度。同法测定未加聚合物的索拉非尼晶态、无定形态的累积溶出度,实验平行3份。收集溶出实验后的残余固体,烘干,进行PXRD表征。

2 结果

2.1PXRD与TMDSC分析结果 见图1。索拉非尼晶态药物在2θ为11.4°,18.62°,22.5°,22.94°,24.78°处具有特征衍射峰,与文献[6]报道一致,而制备的样品整体呈弥散状衍射环,初步判断无定形形成;玻璃化转变温度(Tg)作为特征动力学参数,常用来证实无定形的形成[7]。图2中,制备样品的可逆热流信号中出现一个吸热台阶(Tg=85.32 ℃),进一步证明了无定形的形成。

图1 索拉非尼晶态与无定形态PXRD图谱

2.2影响因素实验 5,10 d时,高温实验药物含量分别为(99.07±0.83)%,(98.54±0.34)%,高湿实验分别为(99.30±0.55)%,(99.07±0.15)%[吸湿增重率分别为(0.62±0.41)%,(1.14±0.22)%],强光照射实验为(99.48±0.18)%,(98.39±0.55)%。与0 d[(99.82±0.22)%]相比,药物外观及含量均无明显变化,表明无定形在高温、高湿及光照条件均可保持较稳定状态。

图2 索拉非尼无定形TMDSC曲线

2.3加速实验 结果见图3。无定形在1 d内保持弥散状衍射环,3 d时在2θ为11.4°,18.62°,22.5°,24.76°处出现了晶体特征衍射峰,说明无定形开始晶化,7 d时,完全转化为晶态,表明无定形在高温高湿条件下稳定性较差。

图3 索拉非尼无定形加速实验的PXRD图谱

2.4非等温动力学稳定性评价 不同升温速率 (β)下,无定形DSC曲线见图4,样品首先发生玻璃化转变,变为过冷液态,然后过冷液体结晶转变为晶态,晶态最终发生熔化。随升温速率增大,Tg、结晶起始温度(Tc)、结晶峰温度(Tp)、结晶结束温度(Te)、晶体熔融峰(Tm)、结晶峰半高宽(ΔTFWHM) 依次升高,具有显著动力学效应。各特征温度数值见表1。

图4 不同升温速率下索拉非尼无定形DSC曲线

2.4.1无定形形成能力评价 无定形形成能力常用来预测无定形药物的结晶趋势[8],可用动力学脆性参数(m)、玻璃化转变温度与熔融温度比值(Tg/Tm)及降低结晶温度(Tr)等物理量来评价[9-10]。

m可用(1)式进行计算[11],Et为玻璃化转变活化能,可通过Moynihan方程(2)及Kissinger方程(3)[12]进行计算:

(1)

(2)

(3)

(1)式求得m为48。m值较小,说明索拉非尼无定形形成能力较强,不容易发生再结晶[11]。

Tg/Tm比值越大,无定形形成能力越强,越不易再结晶[13];Tr=(Tc-Tg)/(Tm-Tg),Tr越大,意味着无定形的结晶趋势越慢[10]。Tg/Tm和Tr数值见表2,不同升温速率下,Tg/Tm值未见明显变化,平均值0.8,比值较高;Tr随着升温速率增加逐渐增加,表明在较快加热条件下,样品结晶延迟,在20 K·min-1升温速率下,Tr值为0.51。综合数值结果,认为索拉非尼无定形形成能力较强,样品不易再结晶。

2.4.2结晶动力学稳定性评价 采用Ozawa方程(4)、Augis-Bennett方程(5)及Kissinger方程(6)[14]计算无定形结晶活化能(Ea)值。

(4)

(5)

(6)

2.5溶解度测定

2.5.1含量测定方法学 聚合物在检测波长268 nm处均无吸收;回归方程A=0.09C-0.02 (r=0.999 6),在2.00～12.00 μg·mL-1范围内线性关系良好;低、中、高(5.60,7.00,8.40 μg·mL-1)浓度日内精密度RSD分别为0.56%,0.96%,0.71%,1.8%,1.4%,0.86% (n=3),RSD均<2.0%;平均回收率101.1%,符合定量分析要求;中浓度溶液12 h内浓度由7.03 μg·mL-1变化至7.02 μg·mL-1,溶液稳定性良好;定量限为0.027 μg·mL-1。因此,该测定方法准确可靠,适用于索拉非尼含量测定。

表1 不同升温速率下索拉非尼无定形结晶特征温度

表3 不同升温速率下晶体生长指数

2.5.2聚合物类型 见图5。聚合物无定形溶解度为7.79 μg·mL-1,是晶态的1.19倍(P<0.05)。所选的聚合物均增加了无定形的溶解度,从低到高依次为低取代羟丙纤维素<聚乙烯醇1788<泊洛沙姆188<羟丙甲基纤维素k15<聚乙烯吡咯烷酮k30<甲基纤维素M450,其中,在有甲基纤维素M450的影响下,无定形溶解度达到11.12 μg·mL-1,是单独无定形的1.43倍(P<0.05)。

2.5.3聚合物用量 甲基纤维素M450用量不同,对延长无定形药物的过饱和时间和抑制结晶的能力也不同。如图6所示,随着甲基纤维素M450浓度增加,无定形溶解度增加程度呈现先升高后降低趋势,当甲基纤维素M450浓度为50 μg·mL-1时,溶解度最大。

2.6粉末体外溶出实验 见图7,在30～45 min时间段内,含有50 μg·mL-1甲基纤维素M450的无定形的累积溶出度从4.20%迅速升至9.89%,是单独无定形的2.17倍(P<0.05),呈现出良好的“弹簧效应”。加甲基纤维素M450的溶液持续增大无定形溶出速率,同时表现出 “降落伞效应”,增大的效应随着时间延长逐渐减弱,4 h时,含有甲基纤维素M450溶液和纯无定形的累积溶出度分别为晶态的3.28倍(P<0.05)和3.14倍(P<0.05)。

图5 索拉非尼无定形在不同种类聚合物溶液中的溶解度

图6 索拉非尼在不同浓度甲基纤维素M450溶液中的溶解度

2.7残余固体PXRD分析 对溶解度及溶出实验的残余固体进行PXRD分析,加和未加聚合物的无定形药物长时间浸泡在溶液后,均出现了与晶态药物完全一致的晶体衍射峰,药物发生了固态相变,由无序的无定形态重新转变为有序晶态。

3 讨论

笔者在本研究采用不同物理量多角度评价索拉非尼无定形形成能力及结晶动力学稳定性。结果表明,无定形形成能力较强,不容易析出晶体,具有良好动力学稳定性。

纤维素类聚合物可通过与药物形成分子间相互作用力、降低药物分子运动、增加介质黏度和诱导抗塑化作用等方式抑制无定形药物结晶,延长无定形药物在溶剂中的过饱和持续时间[17-18]。实验表明,甲基纤维素M450显著提高了索拉非尼无定形药物溶出速率,释放过程展现了良好的“弹簧-降落伞”效应,维持了长时间的过饱和溶解状态,减缓了无定形析出晶体的进程。本研究可为索拉非尼无定形药物配方的设计、生产、贮存及应用提供参考依据。

图7 索拉非尼的体外溶出曲线