氘代药物分析检测技术研究进展*

李琦,谢逸菲,张丽,吕扬,杜冠华

(北京协和医学院,中国医学科学院药物研究所1.药物晶型研究中心,晶型药物研究北京市重点实验室;2.药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室,北京 100050)

氘代药物是指将原药物分子结构中特定位置的氢原子替换为氘原子的新兴药物,其克服了某些原药物代谢不稳定和毒性等问题。由于包含相同原子但不同稳定同位素的化学反应可以表现出不同的反应速率,这一特征被称为动力学同位素效应(kinetic isotope effect,KIE)[1]。KIE使氘代药物在不改变某些药物原有活性的情况下改善原研药物的药动学特征(pharmacokinetics,PK),以期改善药物疗效,延长半衰期,降低给药频率,减弱毒性,减少药物-药物相互作用[2]。

科学家们对氘代药物的研究探索已有60多年历史,直到2017年美国食品药品管理局(FDA)才批准世界第一个氘代药物氘代丁苯那嗪(deutetrabenazine,DTBZ,商品名:安泰坦)上市,DTBZ最早由Auspex公司研发,后来由TEVA公司接受,被FDA批准用于治疗亨廷顿舞蹈病[3-4]。丁苯那嗪是一种泡状单胺转运体-2抑制剂,通过抑制大脑突触囊泡中储存和释放多巴胺发挥药效,由于该药半衰期短及不良反应,限制了其使用。丁苯那嗪氘代后的DTBZ能够通过延长半衰期与峰值血浆浓度相关的不良反应来降低药物代谢并提高耐受性[3]。

长期以来,找到灵敏准确的分析技术来检测含有单一氘的化合物中氘含量是加速氘代药物发展的关键因素之一。通常情况下,区分同位素的检测方法依赖于二者在原子质量和核自旋上的不同,因此,氘代药物的检测分析通常基于质谱法(mass spectrometry,MS)和核磁共振法(nuclear magnetic resonance,NMR)原理来检测同位素[5],核磁-质谱联用和液相-质谱联用是目前常规的检测方法。目前用于氘代药物分析的7种检测技术见图1,其中5种技术方法的原理、优势及不足见表1。

图1 氘代药物分析检测方法

1 氘代药物分析方法

已经进入临床或上市的氘代药物无论是在初期筛选氘代位点还是进入临床阶段,MS和NMR都是目前最为常用的检测方法。上述技术方法是目前氘代药物结构分析最普遍采用的技术手段,在此基础上,研究人员还创新性地提出利用不同分子振动频率的光谱检测方法,如IR和CARS,以及利用SXRD直接得到氘代药物分子结构。

1.1MS法 MS通过检测离子质荷比与相对强度关系对分析物进行定性分析,同时利用离子强度进行定量分析。因此,通过氘代化合物的质荷比差异能够对氘代药物进行定性和定量分析。初步筛选氘代位点对药理活性的影响与非氘代药物相比是否发生变化,采用LC-MS方法时通常需要氘代与非氘代药物两种独立的比较分析,而MS/MS方法不需要进行独立分析,可以作为氘代和非氘代类似物的快速筛选方法,RHYS等[9]采用MS/MS比值法比较在肝微粒体试验中同时混合的氘代和非氘代化合物之间的体外代谢稳定性差异。氢同位素较MS与高分辨/高精度质谱相结合的方法成功应用于代谢-雄激素类固醇甲基烯酮代谢的研究,并已鉴定出40种代谢物[10]。

1.2NMR法 NMR法是利用原子核自旋时产生的磁矩来检测分子结构,通常用于定性分析,很少用于定量分析。

阿伏苯宗的二酮和烯醇异构体相互转化会降低防晒霜的紫外线光稳定性和光保护特性,利用固态NMR可以检测氘代阿伏苯宗的二酮与烯醇转化情况[11]。基于“核磁共振信号强度(I)与激发核的数量(N)成正比”这一原理,NMR可用于定量检测。采用定量核磁共振氢谱,加入内标物比对,测定氘代碘甲烷中残留的氢信号,从而可以计算氘代率。定量核磁共振法的优点是不需要自身对照品,且样品前处理过程较简便,因此将其应用于氘代化合物的氘代率测定尤为合适[12]。

表1 不同氘代药物检测方法优缺点

1.3光谱检测方法

1.3.1CARS CARS通过显微镜利用分子的固有振动共振来驱动光的非弹性散射,用含中子的较重同位素氘选择性地取代氢,可诱导分子发生最小的结构变化,这种方法可以被用作氘代药物的定性或定量研究,目前该方法由于易受到光学参数干扰等原因并未在临床上使用,但可为氘代药物分析检测技术发展提供思路。

使用氘代油酸来优化设置一个内部开发的多模态、多光子、激光扫描显微镜,精确识别在拉曼光谱的碳-氘相关的峰,通过数据分析程序将其分为化学成分的敏感率和浓度,能够在高光谱CARS图像中识别特定氘代化学成分并定量空间分辨率[13]。BERGNER等[14]在双通道微流控芯片中采用拉曼显微光谱法和单波段CARS显微镜法,以对应的非氘代(C-H)同位素为内参物,研究具有脂肪族和芳香族C-D部分的药物浓度依赖性。BOORMAN等[15]指出,拉曼散射系数和拉伸振动的相干拉曼敏感性与氢同位素取代氘下的振动频率大致成比例,可为氘代化合物的定量分析提供思路。

1.3.2IR IR通过激发分子振动获得化合物的特征吸收光谱。由于分子振动频率取决于与激发态化学键中相关的原子质量,因此C-H和C-D键中H与D原子之间的相对质量差异使其吸收不同红外波长辐射[16],因此可以区分氘与非氘键。笔者搜索近5年文献,并没有发现利用IR对氘代药物进行检测的研究,但HEINZE等[17]利用衰减全反射傅里叶变换红外光谱(attenuated total reflectance-fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR)方法,在线测量水中氘浓度,可见利用IR对氘代药物进行检测具有潜力。

1.4SXRD SXRD通常作为研究药物分子晶型与共晶的检测手段[18-19],目前较少见到有研究将其作为氘代药物的检测方法。

“小氢原子”理论模型认为氢(氘)气放电中产生了“小氢原子”,基态电子轨道半径约为普通氢原子玻尔半径的1/274,该小氢原子能级之间的跃迁能产生X射线新谱线[20]。LAALI等[21]合成一系列氘代姜黄素,利用核磁共振技术证实其酮-烯醛构象类似于原类似物,在室温下用二氯甲烷生长出适合单晶,采用SXRD法对其结构进行进一步表征。

单晶X射线衍射法作为研究晶型药物的主要检测手段,已有研究提出“同位素多晶型”概念,其核心是通过同位素取代诱导获得不同的晶体结构[22]。FALK等[23]通过研究证明H-D交换可以避免模型化合物5-甲基-2-[(2-硝基苯基)氨基]-3-噻吩甲腈(5-methyl-2-[(2-nitrophenyl)amino]-3-thiophenecarbonitrile,ROY)伴随多晶型生成,MA等[24]研究发现一种氘取代的铂蛋白衍生物MBRI-001,作为微管蛋白聚合抑制剂,制备获得晶型E(MBRI-001/H2O),利用粉末X射线衍射法(X-ray powder diffraction,PXRD)和SXRD表征并确定了晶型E结构,通过评价发现其具有较好的物理稳定性,适合规模化生产。

2 氘代药物及其代谢产物体内分析技术方法

2.1LC-MS联用 MS是氘代药物药理活性以及进入临床试验阶段氘代药物在人体内代谢过程最为常用的检测方法,通常与高效液相色谱等方法联合使用。

沃替西汀(vortioxetine,商品名:Brintellix)是由日本武田制药公司及丹麦灵北制药有限公司共同研发的一种新型双芳基硫烷基胺类多靶点抗抑郁药物,2013年经FDA批准上市,其通过调节人体5-羟色胺受体并抑制5-羟色胺转运体发挥药效。此外,沃替西汀还有效调节人体免疫系统活性[25-26]。氘代沃替西汀代号为JJH201501,由江苏吉贝尔药业有限公司研发,是将沃替西汀中甲基氢替换成氘的新型药物,目前已经进入临床I期试验阶段,该药化学结构见图2,氘代后的沃替西汀有效提升了药物在体内的稳定性并可减缓代谢速度,从而达到增加药效、减少药物不良反应的目的。

JH201501-01是氘代沃替西汀在体内的主要代谢形式,结构见图2。I期临床试验中,12例成年健康志愿者口服JJH201501片后,采用UPLC-MS/MS法对所采集的血样进行氘代药物含量分析。方法学研究结果表明,该方法指标均符合FDA提出的生物分析方法指南要求[27]。该分析方法目前已成功应用于I期临床试验,可用于JJH201501及其主要代谢物JJH201501-01血浆浓度的临床监测。此外,应用HPLC-MS/MS联用建立大鼠血样中氘代沃替西汀氢溴酸盐(代号:JJH201501)及其代谢物(代号:JJH201501-01)的定量检测方法,并可进行重复给药毒代动力学研究[28]。

丁苯那嗪氘代后的DTBZ临床试验主要采用LC-MS方法进行评估分析[29]。SD-809-C-12试验[30]比较了单次口服剂量DTBZ和丁苯那嗪在禁食状态下给药后的作用效果。丁苯那嗪体内活性代谢物为二氢四苯嗪(alpha-dihydrotetrabenazine,α-HTBZ)和二氢四苯嗪(beta-dihydrotetrabenazine,β-HTBZ),见图3。采用LC-MS/MS分析法分别测定丁苯那嗪和DTBZ代谢物血浆浓度,评估DTBZ对活性代谢物PK特性、安全性和耐受性的影响。研究结果证实,DTBZ活性代谢物在血液中的浓度增加了1倍,有效延长了代谢时间,并在原药物剂量一半的给药量下达到预期药效[31]。

2.2MS-NMR法 MS-NMR法能够准确对氘代药物及其代谢产物分子结构及氘代位点进行有效分析,因此较其他方法更适用于原研药物PK研究。通常使用1HNMR、13CNMR和MS联用表征药物结构。

奥西替尼(osimertinib,商品名:泰瑞莎,研发编号:AZD9291)是由阿斯利康制药有限公司研发的一种高效且有选择性的第3代表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂,是目前晚期EGFR突变阳性非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)的标准护理治疗药物[32]。AZD9291代谢物AZ5104具有毒性作用。研究发现,将氘引入药物分子中可以改变药物的物理性质和体内代谢活性,因此苏州泽璟生物制药股份有限公司对AZD9291进行氘代改造,筛选出氘代产物奥卡替尼,代号为氘代AZD9291。在筛选和合成氘代AZD9291过程中,每一步都通过1H和13C核磁共振谱和高分辨MS来确定合成产物分子结构[33-34],最终合成氘代AZD9291的数据见表2。研究结果显示,氘代AZD9291在体内具有强大的抗肿瘤疗效和良好的PK特性,且毒性明显低于AZD9291,该药目前已进入临床I期试验阶段。

恩扎鲁胺(enzalutamide,ENT,商品名:安可坦)是由安斯泰来制药集团研发的一种雄激素受体竞争性抑制剂,通过抑制核转运及其与DNA的结合,进而促进前列腺癌细胞凋亡,该药已于2012年被FDA批准用于转移性去势抗性前列腺癌的治疗。但其存有潜在的癫痫发作风险和剂量依赖性[35]。化合物中C-H键的裂解是决定代谢速率的关键,氘在代谢过程中C-D键的裂解能够阻碍药物代谢速度并改变代谢途径,同时有效增加药物释放并减少药物毒性。ENT代谢谱显示,ENT中N-去甲基苯甲酰胺(M2)的代谢是通过人类细胞色素P450同工酶CYP2C8和CYP3A4/5进行。海创药业股份有限公司研发了氘代恩扎鲁胺,代号为HC-1119,当N-甲基部分的氢原子被氘取代后,N-去甲基化途径被减弱。研究表明,氘代恩扎鲁胺在小鼠体内显示出更好的抗肿瘤活性,在体内药物释放量升高[36],该药目前已经进入临床III期试验研究。氘代恩扎鲁胺最终通过MS和1H-NMR和13C-NMR来表征分子结构,数据见表2[37]。

图2 氘代沃替西汀及其主要代谢产物化学结构

图3 DTBZ及其主要代谢产物化学结构

表2 氘代奥西替尼和氘代恩扎鲁胺1H-NMR、13C-NMR、MS数据

3 总结与展望

当前,氘代药物定性检测普遍采用NMR法,而在定量方面MS法应用更为普遍。对于新型氘代药物,筛选出具有活性氘代位点结构的药物仍存在挑战。目前,NMR法适用于氘代药物前期分子结构的初步筛查,LC-MS联用法广泛应用于后期氘代药物临床药理活性探究。单一分析方法并不普遍适用于大多数氘代药物的定性或定量检测,每种方法都因自身特点存在一定局限性,在IR法中,由于氘和氢的红外吸收差异较小,更适合作为辅助检测手段;SXRD需要得到适合进行检测的晶体,未来可以进一步研究氘代药物的晶型或共晶;CARS法对于氘的检测信号强度低,容易受到光学系统参数的影响,但是目前该技术有待进一步深入应用探究;MS法给出的碎片离子结构信息具有一定局限性,可能会因为杂质干扰导致检测结果不准确。因此需要对多种方法相结合的检测结果进行综合分析。LC-MS、NMR-MS法是目前最常用的联合检测方法。但任何新兴药物的发展都需要时间的积累,随着科技的不断进步,氘代药物检测方法将越来越成熟,并将有助于推动氘代药物的发展。