下调lncRNA-ATB抑制骨肉瘤发生发展分子机制研究

邱明宪

(河北省衡水市第四人民医院骨科,河北 衡水 053000)

骨肉瘤是一种常发于儿童或青少年的恶性肿瘤之一［1］,近年来虽然对骨肉瘤的治疗方法已有一定改进,但现阶段骨肉瘤的治疗效果和预后仍不够理想［2］,其具体发病分子机制也未得到充分的探讨。因此寻找新的特异性靶向因子显得尤为重要。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一种长度>200的内源性非编码RNA［3］,已证实lncRNAs参与调控多种生物学进程［4］,且可能在恶性癌症早筛以及治疗中具有巨大潜能［5］。如牛磺酸上调基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)在骨肉瘤组织中的表达升高,过表达/敲除TUG1分别增加/减少骨肉瘤细胞的活力、迁移以及侵袭［6］;另外一项研究显示lncRNA CBR3-AS1在骨肉瘤组织和细胞系中高表达,并与Enneking分期、远处转移和组织学分级相关［7］。LncRNA-ATB是一种主要由转化生长因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)激活的长链非编码RNA,多项报道［8-9］显示其参与了人类疾病的特定生理和病理过程,可作为癌基因在多项恶性肿瘤中异常高表达,有作为癌症的生物标志物潜力,Huang等［10］研究显示LncRNA-ATB在喉癌组织样本中异常高表达,与T分级和临床分期有关,并且lncRNA-ATB高表达患者的总生存率明显低于低表达组;Tang等［11］研究显示在胶质瘤中,lncRNA-ATB可通过核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和P38/MAPK通路促进TGF-β诱导的胶质瘤细胞侵袭。然而迄今为止lncRNA-ATB在骨肉瘤中的工作机制暂未阐明,本研究旨在通过体内、体外两方面深入探究lncRNA-ATB在骨肉瘤中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 研究中所有组织样本取自2020年1月—2021年1月衡水市第四人民医院经病理确诊的28例患者手术切除的肿瘤标本及癌旁组织标本,其中男性19例、女性9例,平均年龄(17±5)岁,病理分析采用第8版骨肉瘤TNM分期标准,其中早期(Ⅰ～Ⅱ)20例,晚期(Ⅲ)8例。病例纳入标准:①经病理组织学确诊为骨肉瘤;②术前未接受化疗、放疗、分子靶向治疗及生物治疗;③患者未有感染性或系统性重大疾病者。

本研究经医院伦理委员会批准［(2020)伦审第(53)号］,并已取得了患者的知情同意。

1.2主要试剂 人骨肉瘤细胞HOS、Saos-2和U2OS细胞株及正常人成骨细胞株NHOst购自美国ATCC,DMEM培养基;lncRNA-ATB过表达质粒以及其阴性对照、lncRNA-ATB表达抑制质粒以及其阴性对照质粒、实时定量-聚合酶链式反应(real time quantity polymerase chain reaction,qRT-PCR)试剂盒、TRIzol试剂盒均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,Transwell小室购自美国密理博公司,一抗与辣根过氧化物酶标记的二抗均购自Abcam公司。Tunel凋亡检测试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养和转染 人骨肉瘤细胞HOS、Saos-2和U2OS细胞株及正常人成骨细胞株NHOst使用含10%胎牛血清,100 mg/L青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640做为细胞培养液,培养条件为37 ℃含95%空气和5% CO2。转染前24 h将生长状态良好的Saos-2细胞按5×105个/孔接种于6孔板,按照转染试剂LipofectamineTM 2000 试剂说明书对细胞进行转染,将Saos-2细胞分为ATB组、NC组、siATB组以及siNC组,分别转染ATB过表达质粒以及其阴性对照;ATB表达抑制质粒以及其阴性对照质粒。

1.3.2qRT-PCR检测骨肉瘤组织和细胞株lncRNA-ATB表达 使用Trizol从细胞系或组织中提取总RNA,紫外分光光度法测定RNA的含量,琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。采用逆转录试剂盒将提取的总RNA合成cDNA,按照qRT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应,qRT-PCR结果以2-△△CT值形式得到,每个样本重复3次。引物序列如下:lncRNA ATB-F:5′-CTTCACCAGCACCCA-GAGA-3′,lncRNA ATB-R:5′-AAGACAGAAAA-ACAGTTCCGAGTC-3′;GAPDH-F:5′-GGTGAA-GGTCGGAGTCAACG-3′,GAPDH-R:5′-CAAA-GTTGTCATGGATGHACC-3′。

1.3.3CCK8实验检测Saos-2细胞增殖能力 Saos-2细胞按接种于96孔板,每孔200 μL细胞悬液,使用CCK-8试剂盒,用酶标仪测定450 nm处的吸光度(optical density,OD)值。

1.3.4流式细胞法检测Saos-2细胞细胞周期 将对数生长期的Saos-2细胞收集于5 mL离心管中,用0.01%胰蛋白酶消化30 min。用普通离心机100×g离心5 min后弃上清,再用预冷的PBS洗涤1次,100×g离心5 min后弃上清,收集细胞于同一5 mL流式离心管中,然后用4 ℃预冷的70%乙醇固定细胞1 h。去除乙醇后用PBS洗涤1次,用细胞染色液重悬细胞,并调整细胞密度为1×106个/mL,最后用流式细胞仪检测细胞周期。

1.3.5Transwell侵袭实验检测Saos-2细胞迁移能力 骨肉瘤Saos-2细胞接种用Matrigel凝胶包被的上腔进行侵袭实验,将不含血清的培养基和含10%FBS的培养基分别添加到上孔和下孔中,继续培养24 h。然后,小心地去除非侵袭性细胞。滤光片用90%乙醇固定,结晶紫染色。用倒置显微镜观察下层细胞,每个实验重复3次。

1.3.6Tunel实验检测Saos-2细胞凋亡 Saos-2细胞用4%多聚甲醛固定30～60 min,用原位细胞凋亡检测试剂盒检测TUNEL染色,并根据制造商的指示用DAPI染色10 min,荧光显微镜下观察Tunel阳性细胞数。

1.3.7免疫组织化学检测骨肉瘤肿瘤组织lncRNA-ATB表达 骨肉瘤肿瘤组织用4%福尔马林固定,石蜡包埋,切片厚3 μm。石蜡切片梯度脱蜡、水化后,加入3%H2O2溶液室温孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶活性。将切片置于柠檬酸盐抗原修复液中,进行抗原修复。加入5%的正常羊血清封闭15 min。随后加入1∶100比例稀释的Ki67抗体。加入辣根过氧化物酶标记的兔二抗(1∶200),37 ℃孵育30 min。采用3,3-二氨基联苯胺显色后,苏木精室温复染2 min,而后进行脱水和中性树脂封片,采用正置显微镜观察切片。

1.3.8构建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型检测lncRNA-ATB对体内增殖和肿瘤生长情况 选取BALB/c裸鼠32只,5～9周,体重14～21 g,所有裸鼠随机分为ATB组,siATB组及各自对照组,每组8只。Saos-2细胞转染后,每只裸鼠接种细胞数为1×106个/只。21 d将裸鼠置于无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级动物实验室正常饲养。裸鼠接种细胞21 d后腹腔注射水合氯醛麻醉(0.01 mL/g)并引颈脱臼处死裸鼠,从皮下去除其肿瘤组织并称重,测量体积及甲醛固定。

1.4统计学方法 应用SPSS Statistics 22.0统计软件分析数据。计量资料比较采用t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1骨肉瘤组织和细胞株中lncRNA-ATB的表达水平 采用GeneCards生信软件(https://www.genecards.org/),找到lncRNA-ATB在染色体上的位置,qRT-PCR结果显示,28例患者组织中,骨肉瘤组织中的lncRNA-ATB表达水平(2.31±0.37)高于癌旁正常组织(1.00±0.09),差异有统计学意义(t=8.427,P<0.001),见图1。与NHOst组相比,lncRNA-ATB在HOS,Saos-2和U2OS中均升高,其中Saos-2中表达最高,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。因此选择Saos-2细胞株用于后续实验。

表1 骨肉瘤细胞株中ATB相对表达Table 1 Relative expression of ATB in osteosarcoma cell lines

组别ATB相对表达NHOst组1.00±0.09HOS组2.24±0.18*U2OS组3.11±0.28*Saos-2组3.47±0.32*#△ F值39.634 P值<0.001

*P值<0.05与NHOst组比较 #P值<0.05与HOS组比较 △P值<0.05与U2OS组比较(SNK-q检验)

图1 lncRNA-ATB在染色体上的位置

2.2lncRNA-ATB对 Saos-2细胞增殖、周期、迁移和凋亡的调控作用 ATB组Saos-2细胞的OD值高于NC组,ATB组Saos-2周期S期长于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。siATB组Saos-2细胞OD值低于siNC组;siATB组Saos-2周期S期短于siNC组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2,3。ATB组能抑制Saos-2细胞凋亡率,而siATB组后则相反增加Saos-2细胞的凋亡率,ATB组的细胞穿孔数多于NC组,siATB组少于siNC组,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

表2 NC组和ATB组Saos-2细胞增殖与周期的比较Table 2 Comparison of the proliferation and cycle of Saos-2 cells between NC group and ATB group

表2 NC组和ATB组Saos-2细胞增殖与周期的比较Table 2 Comparison of the proliferation and cycle of Saos-2 cells between NC group and ATB group

组别OD值S期细胞比例(%)NC组 1.41±0.1212.37±1.25ATB组2.61±0.1817.14±1.67t值13.5874.427P值<0.0010.010

表3 siNC组和siATB组Saos-2细胞增殖与周期的比较Table 2 Comparison of Saos-2 cell proliferation and cell cycle between the SINC group and the SIATB group

表3 siNC组和siATB组Saos-2细胞增殖与周期的比较Table 2 Comparison of Saos-2 cell proliferation and cell cycle between the SINC group and the SIATB group

组别OD值S期细胞比例(%)siNC组 1.52±0.1413.85±1.31siATB组0.49±0.054.02±0.27t值16.97118.002P值<0.001<0.001

图2 lncRNA-ATB对 Saos-2细胞增殖,周期,迁移和凋亡的调控作用

2.3构建骨肉瘤裸鼠模型检测lncRNA-ATB对体内肿瘤增殖和肿瘤生长情况 利用Saos-2细胞构建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型,21 d后剥离瘤体称重,结果显示,ATB组(1.09±0.08)皮下肿瘤重量重于NC组(0.58±0.03),差异有统计学意义(t=10.339,P<0.001),siATB组(0.36±0.03)皮下肿瘤重量轻于siNC组(0.71±0.06),差异有统计学意义(t=9.037,P<0.001)。选取组织进行切片,Ki67实验检测皮,结果显示ATB组下骨肉瘤细胞核中阳性染色细胞百分比多于NC组,siATB组下骨肉瘤细胞核中阳性染色细胞百分比少于siNC组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3 。

图3 构建骨肉瘤裸鼠模型检测增殖和肿瘤生长情况

3 讨 论

LncRNA作为细胞生物学领域的研究热点,越来越多的证据［12-13］表明其可用来评估骨肉瘤的发展和转移的风险。LncRNA-ATB 是近年来显示的由TGF-β表达激活的一种长链非编码RNA,已被证明可用于多种人类癌症的预后标志物。TGF-β是促进骨肉瘤进展的重要细胞因子,有研究显示通过抑制TGF-β1表达,进而对骨肉瘤细胞的迁移和侵袭产生抑制作用,因而lncRNA-ATB也可能是骨肉瘤相关的重要lncRNA。但目前关于lncRNA-ATB在骨肉瘤中作用机制的研究甚少。现有研究已显示lncRNA-ATB在包括肝细胞癌、肺癌、卵巢癌在内的多种癌症中表达异常,Yuan等［14］学者研究显示,lncRNA-ATB在卵巢癌中异常高表达,沉默LncRNA-ATB可显著抑制卵巢癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡;Li等［15］研究显示lncRNA-ATB在肺癌组织中表达上调,并与肿瘤大小和转移相关,另外一项研究［16］提示在乳腺癌中,lncRNA-ATB 表达同样异常升高,敲低lnc-ATB显著抑制乳腺癌细胞的上皮-间充质转化等。本研究显示,lncRNA-ATB在骨肉瘤组织以及HOS、Saos-2和U2OS细胞系中都呈现不同程度高表达,提示lncRNA-ATB的异常表达可能与骨肉瘤密切相关。为了进一步验证lncRNA-ATB在骨肉瘤中的调控机制,构建骨肉瘤裸鼠模型,通过体内验证lncRNA-ATB对骨肉瘤肿瘤生长的影响,显示过表达lncRNA-ATB促进肿瘤的生长和体内细胞增殖,而抑制lncRNA-ATB则能产生抗肿瘤生长和抑制增殖的效应。通过造模体内实验的验证,更加确信lncRNA-ATB参与了骨肉瘤的病理进程,与其发生发展密切相关。

骨肉瘤是最具侵袭性的恶性肿瘤之一,具有较高的发病率和较低的治愈率,因此细胞实验探究lncRNA对骨肉瘤细胞生物学功能显得至关重要。近年来,研究［17］表明lncRNAs可促进/抑制肿瘤细胞增殖等生物学行为进而在癌症中发挥重要作用,在骨肉瘤相关报道［18］中,通过细胞功能实验显示过表达lncRNA-TUSC7抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,同时促进体外细胞凋亡;Han等［19］研究显示在骨肉瘤中,lncRNA-BCRT1表达增高可促进骨肉瘤细胞的生长和细胞周期;Chen等［20］显示LOC100129620能促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移。本研究显示lncRNA-ATB在HOS、Saos-2和U2OS多种骨肉瘤细胞系中均显著升高,其中Saos-2中表达最高,因此选择Saos-2细胞株用于后续实验,探究lncRNA-ATB在骨肉瘤细胞恶性生物学行为中的影响。结果显示,lncRNA-ATB可以促进Saos-2细胞增殖,周期S期的聚集,增加细胞迁移率及抑制细胞凋亡,而采用RNA干扰技术后显示,干扰lncRNA-ATB可以产生抑制增殖、周期、迁移及促进凋亡的效果。

综上所述,本研究充分地阐述了干扰lncRNA-ATB表达可以抑制人骨肉瘤Saos-2细胞增殖、周期、迁移及促进细胞凋亡,并且抑制体内肿瘤生长,但本研究也具有一定的局限性,基于lncRNA作用机制,在后续的相关研究中,将深入探究lncRNA-ATB做为ceRNA调控下游miRNA在骨肉瘤中的作用机制,为对抗骨肉瘤的调控机制作出全新的诠释,为抗骨肉瘤早筛及治疗提供新的潜在靶点。