Galectin-1/RAMP在脓毒血症患者中的表达及对炎性信号通路的调控分子机制研究

杜 蕊,郝丽娜,宋绍华,李栋梁 ,王 来, 赵志涛

(河北医科大学第一医院重症医学科,河北 石家庄 050000)

脓毒血症是对感染反应失调导致的器官功能障碍综合症,临床症状包括寒战、发热、心悸、气促、精神状态改变等,严重时可致器官功能及循环障碍,病死率高［1-3］。流行病学研究脓毒症发生率高,全球每年有超过1 800万严重脓毒症病例,并且以每年1.5%～8.0%的速度上升［4-5］。半乳糖凝集素1(galactose lectin 1,Galectin-1)是半乳糖凝集素家族成员之一,在细菌和病毒感染中发挥作用,还参与神经系统发育和生殖过程,也参与免疫,炎症,恶性肿瘤,神经系统发育,生殖,骨骼肌生长分化等诸多过程［6-8］,但Galectin-1在脓毒血症中的作用尚不清晰。重组受体活性修饰蛋白(recombinant receptor activity modifying protein,RAMP)是调控炎症信号通路的重要分子,研究表明RAMP-/-小鼠术后淋巴水肿加重,淋巴引流异常,心脏淋巴管异常和心力衰竭延迟发作［9-10］,但是RAMP通路分子是否在脓毒血症患者中异常表达,并且是否受到Galectin-1的调控尚不清晰。因此本研究将于临床收集脓毒血症患者,分析其外周血Galectin-1及RAMP表达水平,并通过细胞学实验探究Galectin-1在单核细胞中对ID3/RAMP信号通路的影响,为Galectin-1在脓毒血症中发挥的作用提供理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取河北医科大学第一医院2020年5月—2022年5月门诊及住院的脓毒血症患者80例,并收集健康志愿者作为对照80例,抽取患者10 mL外周血,脓毒血症的纳入标准参考《第三版脓毒症与感染性休克定义的国际共识(简称“脓毒症3.0”)》,机体对于感染的失控反应所导致可以威胁生命的器官功能障碍,sepsis 3.0=感染+SOFA≥2。排除标准:①临床资料严重缺失者。②年龄<18岁。③慢性不可逆疾病如慢性肾功能不全需肾脏替代治疗者、恶性肿瘤、血液系统疾病患者。

所有患者均签署知情同意书,本研究经过河北医科大学第一医院伦理委员会审核通过。

单核细胞株TCP-1购自国家实验细胞资源共享平台(北京)。

1.2主要试剂及仪器 真空采血管购于美国BD公司,高糖培养基DMEM,胎牛血清和青链霉素购于美国sigma公司;10 cm细胞培养皿、15 mL离心管购于美国corning公司;酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购于美国R&D Systems有限公司,CRISPR-Cas9质粒和gRNA及引物由上海生物生工有限公司设计并合成,7500qPCR仪购于美国ABI公司,Western blot电泳仪购于美国BIO-RAD公司。

1.3方法

1.3.1ELISA检患者外周血血清Galectin-1和RAMP表达水平 于同一时间用真空采血管收集患者外周血10 mL,置于4 ℃离心机,3 000 r/min,离心15 min,收集上清液,分装到1.5 mL EP管中,冷冻。检测时严格按照试剂盒说明采用ELISA检测外周血中Galectin-1和RAMP表达水平,于酶标仪下在吸光度450 nm下进行各样本吸光度,所有样本3个重复。

1.3.2细胞培养及转染条件 TCP-1培养条件:DMEM培养液中含有10%胎牛血清、1%青链霉素,CO2培养箱内培养,5% CO2,37 ℃静置培养;转染时严格按照说明书转染NC载体和Galectin-1 CRISPR-Cas9质粒,在24孔板中,以细胞密度为30%～50%铺板,并根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度,第2天每个孔转染,方式如下:A将20 pmol SIRNA溶于50 μL Opti-mem无血清培养基中。B将1 μL lipo2000溶于50 μL Opti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5 min。C将AB两管混合,放置20 min。转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400 μL。将C管mix加入24孔板对应孔中6 h候换成有血清培养基,48 h候用于各组检测。无序siRNA转染的细胞即为NC组,Galectin-1 CRISPR-Cas9质粒转染存活的细胞即为敲除Galectin-1组。

1.3.3细胞上清液炎症因子检测 吸取单核细胞上清液,用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为 0.5～20 mg/L,按 100 μL/孔加入酶标板,4 ℃包被 过夜。次日弃去孔内液体,轻轻叩打以吸去残留液体,加入洗涤液(280～300 μL/孔),漂洗2～3次,每次3～5 min;按200～250 μL/孔加入封闭液,室温2～3 h后弃去孔内封闭液;用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释至所需浓度,抗体孵育后于酶标仪下在吸光度450 nm下进行各样本吸光度,所有样本3个重复。

1.3.4qPCR检测RAMP和ID3表达水平 于冰上,采用1 mL Trizol提取总RNA,严格按照盒逆转录试剂进行逆转录,通过qPCR仪对RAMP和ID3进行mRNA表达水平检测,引物序列为:RAMP F,5′-CCTCGTGGAGCCAGTTATCAA-3′,R,5′-GTCTGGGATCTCCACCGTCTTC-3′;ID3,F,5′-GAGAGGCACTCAGCTTAGCC-3′,R,5′-GAGAGGCACTCAGCTTAGCC-3′;F,5′-CCC-ATGGGACAACATTCCAA-3′,R,5′-CATGGCG-ACAAGCTCGGTA-3′;GAPDHF,5′-TCTTC-TTTTGCGTCGCCAG-3′,5′-ATCTTCTTTTGC-GTCGCCAG-3′所有操作在冰上进行并避免RNA酶污染。7500Fast系统进行实时荧光定量PCR的条件为:预变性95 ℃10 min,变性95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 35 s,35个循环,以GAPDH分别作为内参,以2-△△Ct计算RAMP和ID3相对表达量。

1.3.5Western blot检测 RAMP和ID3蛋白表达水平将各组细胞冰上RIPA蛋白裂解液在提取总蛋白,BCA法对蛋白浓度进行测定。加入5×SDS的蛋白上样缓冲液煮沸后分装于EP管,储存于-80 ℃备用。浓缩胶电压80 V 10 min,分离胶电压120 V 2 h,转至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭。加入特异性一抗RAMP(1∶1 500,ab72264,英国abcam公司)、ID3抗体(1∶1 000,ab236505,英国Abcam公司)和GAPDH(1∶5 000,ab181602,英国Abcam公司)于4 ℃冰箱过夜。洗膜后加入特异性的羊抗兔二抗(1∶2 000),孵育1 h。TBST洗膜3次,每次5 min,采用ECL化学发光液曝光显影,于全自动蛋白分析仪BN ProSpec System成像并进行分析。

1.4统计学方法 应用SPSS 23.0统计软件分析数据。计量资料采用独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1脓毒血症患者一般资料及外周血抗炎通路Galectin-1和RAMP表达水平分析 本研究中最终入组脓毒症患者80例,年龄23～69岁,平均年龄(41.45±5.21)岁,男性45例,女性35例,革兰阴性菌感染38例、革兰阳性菌感染42例;生理与慢性健康评分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)为21.16±5.72。通过ELISA法检测脓毒血症患者外周血抗炎通路Galectin-1和RAMP表达水平,与对照组相比,脓毒血症患者外周血Galectin-1和RAMP表达升高,差异有统计学意义(P<0.01),见表1。

表1 脓毒血症患者外周血Galectin-1和RAMP表达水平分析Table 1 Analysis of Galectin-1 and RAMP expression levels in peripheral blood of patients with sepsis

表1 脓毒血症患者外周血Galectin-1和RAMP表达水平分析Table 1 Analysis of Galectin-1 and RAMP expression levels in peripheral blood of patients with sepsis

组别 Galectin-1RAMP对照组 36.251±4.83233.271±2.181脓毒血症组51.232±3.11645.292±1.131t值 9.1639.201P值 <0.01<0.01

2.2敲除Galectin-1对单核细胞TCP-1炎症因子代谢的影响 检测敲除Galectin-1对单核细胞TCP-1炎症因子代谢的影响,与对照组和NC组相比,敲除Galectin-1组细胞白细胞介素6(interleukin 6,IL-6),白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)和白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),NC组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 Crisper敲除Galectin-1对单核细胞TCP-1炎症因子代谢的影响Table 2 Effect of Crisper knockdown galactin-1 on the metabolism of TCP-1 inflammatory factors in monocytes

表2 Crisper敲除Galectin-1对单核细胞TCP-1炎症因子代谢的影响Table 2 Effect of Crisper knockdown galactin-1 on the metabolism of TCP-1 inflammatory factors in monocytes

组别IL-6IL-8IL-10对照组84.557±9.91475.258±9.42190.18±8.041NC组85.092±6.81976.094±8.04189.82±8.821敲除Galectin-1组103.810±2.031*100.410±5.102*109.41±5.012*F值98.51298.90296.007P值<0.001<0.001<0.001

*P值<0.05与对照组比较(SNK-q检验)

2.3敲除Galectin-1对TCP-1单核细胞炎症通路ID3/RAMP mRNA表达水平的影响 通过qPCR检测各组单核细胞炎症通路ID3/RAMP mRNA表达水平,与对照和NC组相比,敲除Galectin-1组细胞炎症通路ID3/RAMP mRNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),NC组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 Galectin-1对单核细胞 TCP-1细胞能量代谢分子ID3和Irisin mRNA表达水平的影响Table 3 Effect of Galectin-1 on the expression of ID3 and Irisin mRNA in monocyte TCP-1

表3 Galectin-1对单核细胞 TCP-1细胞能量代谢分子ID3和Irisin mRNA表达水平的影响Table 3 Effect of Galectin-1 on the expression of ID3 and Irisin mRNA in monocyte TCP-1

组别Id3RAMP对照组1.019±0.0191.819±0.052NC组1.007±0.0121.814±0.041敲除Galectin-1组2.211±0.101*2.911±0.311* F值98.62198.721 P值<0.001<0.001

*P值<0.05与对照组比较(SNK-q检验)

2.4敲除Galectin-1对TCP-1单核细胞炎症通路ID3/RAMP蛋白表达水平的影响 通过Western blot检测各组细胞TCP-1单核细胞炎症通路ID3/RAMP蛋白表达水平的影响,与对照组合NC组相比,敲除Galectin-1组细胞炎症通路ID3和RAMP蛋白显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),NC组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图1,表4。

图1 Crisper敲除Galectin-1对TCP-1单核细胞炎症通路ID3/RAMP 蛋白表达水平的影响

表4 Crisper敲除Galectin-1对TCP-1单核细胞炎症通路ID3/RAMP蛋白表达水平的影响Table 4 Effect of knockdown galactin-1 on the expression level of ID3/RAMP protein in inflammatory pathway of monocyte TCP-1

表4 Crisper敲除Galectin-1对TCP-1单核细胞炎症通路ID3/RAMP蛋白表达水平的影响Table 4 Effect of knockdown galactin-1 on the expression level of ID3/RAMP protein in inflammatory pathway of monocyte TCP-1

组别ID3RAMP对照组0.194±0.0191.049±0.025NC组0.187±0.0211.044±0.014敲除Galectin-1组0.471±0.011*1.321±0.021* F值98.82098.910 P值<0.001<0.001

*P值<0.05与对照组比较(SNK-q检验)

3 讨 论

脓毒血症是由感染引起的生理学、病理学以及生物化学异常的临床综合症,严重脓毒常伴有器官功能障碍、组织灌注不良或低血压,给予足量的液体复苏后仍然伴有无法纠正的持续性低血压,会重威胁患者生命的安全［11-13］。脓毒症可以由任何部位的感染引起,临床上常见于肺炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿系统感染、蜂窝织炎、脑膜炎、脓肿等。脓毒血症病原微生物包括细菌、真菌、病毒及寄生虫等,发病机制尚不明确,涉及到复杂的全身炎症网络效应、免疫功能障碍、凝血功能异常及宿主对不同感染病原微生物及其毒素的异常反应等多个方面因素［14-15］。Galectin-1是一种机体内的稳态信号,与抗炎介质和RAMP作用参与炎症免疫病理过程,包括抑制急性炎症;抑制T细胞介导的自身免疫性疾病;改善移植物抗宿主病;使免疫反应的特征偏向于Th2型等。在调控T细胞、B细胞、巨噬细胞、粒细胞等多种免疫细胞,促进免疫耐受,下调先天性和适应性免疫应答中也发挥重要作用［16-18］,但Galectin-1在脓毒血症患者中的表达和作用尚不清晰。因此本研究通过临床试验获取脓毒血症患者,通过ELISA分析其血清中Galectin-1和RAMP的表达水平,结果证实脓毒血症患者Galectin-1和RAMP表达水平升高,提示出在脓毒血症患者可能出现抑制炎症因子释放的过程,因此我们进一步通过细胞学实验敲除Galectin-1以确认对炎症因子释放的影响,通过Crispr-cas9技术敲除Galectin-1后,发现炎症因子IL-6、IL-8和IL-10表达水平降低,由此提示Galectin-1可能对的单核细胞炎症因子释放有关,从而提示患者血清中Galectin-1可能通过炎症因子调控对脓毒血症有一定的保护作用。

RAMP/ID3信号通路是炎症信号通路的重要调控通路,可以调控发热有关的炎症因子如白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子等,同时对以中性粒细胞为主的免疫反应具有调控作用,并且巨噬细胞或树突细胞等单核细胞的发育具有调控作用［19］。研究表明:RAMP-/-小鼠的CD11b+细胞数量高于野生型小鼠,并且与促炎性巨噬细胞表型相关基因的表达上调和修复性巨噬细胞表型相关表达的下调有关。免疫细胞中的RAMP信号在炎症相关淋巴管生成中起关键作用,是控制淋巴管生成的重要调控靶点［20］,但是Galectin-1/RAMP炎症通路对脓毒血症中的作用尚不清。因此通过细胞学实验进一步探究了Galectin-1信号通路的作用,通过敲除Galectin-1,结果证实在缺乏Galectin-1的情况下,单核细胞RAMP和ID3 mRNA和蛋白的表达水平显著上升,提示炎症控制能力的抑制,结合ELISA炎症因子白细胞介素6、白细胞介素8和白细胞介素10释放显著上升,证实Galectin-1可能通过调控RAMP和ID3的表达干预炎症因子释放,在脓毒血症中发挥一定的保护作用。

综上所述,本研究证实Galectin-1可以通过调控RAMP信号通路,参与单核细胞炎症代谢过程,临床发现的脓毒血症患者Galectin-1和RAMP表达异常可能与患者患病有关。本研究目前尚不能确定脓毒血症患者Galectin-1和RAMP表达异常与脓毒血症炎症因子释放的因果关系,因此后续研究可以针对健康志愿者和脓毒血症患者进行系统性分析,明确Galectin-1在单核细胞炎症代谢和脓毒血症发生的因果关系。