circAMOTL1靶向调控miR-379-5p对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

周毛仔 陈怡 周进军

宫颈癌是常见的妇科恶性癌症,其全球范围死亡率和发病率在所有女性癌症位居第四,对女性健康造成严重的威胁,宫颈癌早期发现常用外科手术切除,治疗效果明显,但是70%宫颈癌患者发现时已经处于晚期,一些情况下还伴有转移、侵袭等出现[1,2]。近年来,靶向治疗是当前宫颈癌研究和治疗的热点。环状RNA(circRNA)是非编码RNA分子的一员,具有稳定的环状闭合结构,circRNA被发现具有致癌性和抑制性,对多种人类疾病和癌症至关重要[3,4]。最近的研究发现,circAMOTL1在宫颈癌组织和细胞表达上调,敲低circAMOTL1能抑制宫颈癌细胞的增殖和转移,并诱导细胞的凋亡,通过调控miR-526b/SIK2轴促进宫颈癌恶性发展[5]。circRNA与下游miRNA能相互作用参与肿瘤细胞的发生和发展,miR-379-5p多种癌症中表达下调(如肝癌、非小细胞肺癌等),过表达miR-379-5p能抑制癌细胞的增殖和促进细胞凋亡[6,7]。关于circAMOTL1和miR-379-5p二者间的研究尚不明确,通过在线数据库预测显示circAMOTL1和miR-379-5p存在互补的核苷酸序列,本研究以宫颈癌细胞Caski为研究对象,观察circAMOTL1靶向miR-379-5p的表达对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 从本院收集30例宫颈癌患者组织和癌旁组织,经过专家对其病理确认为宫颈癌组织和癌旁组织,将组织放在液氮罐内冷冻保存。所有患者在进行手术前未进行任何化疗或放疗,且患者均签署了患者知情同意书。该研究已经获得了本院伦理委员会同意。

1.2 细胞与主要试剂 正常宫颈上皮细胞End1/E6E7、宫颈癌细胞SiHa、Caski、HeLa、C33a购自上海细胞库;胎牛血清、DMEM培养基购自美国Hyclone公司;si-NC、si-circAMOTL1、pcDNA、pcDNA-circAMOTL1、anti-miR-NC、anti-miR-379-5p、引物由上海吉玛设计合成;LipofectamineTM2000试剂盒购自上海加科生物科技有限公司;TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司;MTT试剂盒购自碧云天生物;周期试剂盒、凋亡试剂盒购自江苏凯基生物;CyclinD1抗体、Ki67抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、GAPDH抗体、标记的二抗购自北京奥维亚生物技术有限公司;荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。

1.3 细胞培养与转染 取正常宫颈上皮细胞End1/E6E7、宫颈癌细胞SiHa、Caski、HeLa、C33a于37℃、5% CO2培养内进行培养,细胞须含有10%胎牛血清的DMEM培养基。细胞生长融合至85%时,加入胰蛋白酶进行消化传代培养细胞。取对数期Caski细胞以每孔内接种2×105个,并接种至6孔板中,按照脂质体法将si-NC、si-circAMOTL1、pcDNA、pcDNA-circAMOTL1转染至细胞内,记为si-NC组、si-circAMOTL1组、pcDNA组、pcDNA-circAMOTL1组;将si-circAMOTL1和anti-miR-NC、si-circAMOTL1和anti-miR-379-5p共转染至细胞内,记为si-circAMOTL1+anti-miR-NC组、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p组。

1.4 qRT-PCR检测circAMOTL1和miR-379-5p的表达量 取癌旁组织、宫颈癌组织、正常宫颈上皮细胞End1/E6E7、宫颈癌细胞(SiHa、Caski、HeLa、C33a)、以及各组Caski细胞,加入TRIzol试剂用于提取总RNA,对RNA进行定量和评估。然后配置逆转录反应体系,取3 μg的总RNA将其逆转录为cDNA,根据荧光定量试剂盒说明书步骤配置反应体系,在PCR仪器进行PCR反应。以GAPDH和U6作为内参,采用2-ΔΔCt法计算circAMOTL1和miR-379-5p的表达量。circAMOTL Forward:5’-GATGGTCAAGCCCTACCCTG-3’,Reverse:5’-CCCTGATGCTACTGGTTGCC-3’;miR-379-5p Forward:5’-GCGCTGGTAGACTATGGAA-3’,Reverse:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.5 MTT检测细胞增殖 取si-NC组、si-circAMOTL1组、si-circAMOTL1+anti-miR-NC组、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p组的Caski细胞,并接种至96孔板中,每孔接种2 000个,放置培养箱内培养48 h、72 h,在每孔内加入20 μl的MTT试剂,继续培养4 h吸去培养液,加入150 μl二甲基亚砜试剂。用酶标仪于490 nm处检测每孔内吸光度值。

1.6 流式细胞术检测细胞周期和凋亡 取对数期si-NC组、si-circAMOTL1组、si-circAMOTL1+anti-miR-NC组、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p组的Caski细胞,培养48 h后吸取10 ml上清液至EP管内,加入胰蛋白酶进行消化,冲洗2遍,加入预冷75%乙醇试剂进行重悬,4℃固定24 h,按照周期试剂盒说明书,加入RNA酶孵育20 min,然后加入PI试剂,避光反应30 min,置于流式细胞仪检测细胞周期变化。加入胰酶消化后,按照凋亡试剂盒说明,将100 μl的Binding Buffer与Annexin V-FITC和PI试剂混匀,避光反应15 min,置于流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。

1.7 Western blot检测CyclinD1、Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表达 取对数期si-NC组、si-circAMOTL1组、si-circAMOTL1+anti-miR-NC组、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p组的Caski细胞,加入蛋白裂解液,冰上反应30 min提取各组细胞内总蛋白,按照BCA法定量评估蛋白。每孔上样量为30 μg与上样缓冲液反应3 min,行SDS-PAGE处理,将处理的蛋白转移PVDF膜上,然后用脱脂奶粉封闭培养1 h,洗膜3次,加入CyclinD1、Ki67、Bax、Bcl-2和GAPDH抗体,4℃孵育过夜,室温下加入带有标记的二抗,孵育1 h,在PVDF膜滴加ECL显色液,显色、曝光。应用Image分析蛋白条带灰度值,以GAPDH为内参。

1.8 双荧光素酶报告实验检测circAMOTL1和miR-379-5p的靶向关系 通过在线数据库预测circAMOTL1 3’UTR与miR-379-5p结合位点,为了验证miR-379-5p是否是circAMOTL1的靶标。将构建circAMOTL1野生型(circAMOTL1 WT)和突变型(circAMOTL1 MUT)荧光序列载体与miR-NC或miR-379-5p共转染至Caski细胞内,培养48 h后,根据荧光素酶检测试剂盒说明书检测细胞内荧光素酶活性。

2 结果

2.1 circAMOTL1和miR-379-5p在宫颈癌组织中的表达 与癌旁组相比,宫颈癌组织内circAMOTL1表达量显著增加(P<0.05),miR-379-5p表达量显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 circAMOTL1和miR-379-5p在宫颈癌组织中的表达

2.2 circAMOTL1和miR-379-5p在宫颈癌细胞中的表达 与正常宫颈上皮细胞End1/E6E7相比,宫颈癌细胞SiHa、Caski、HeLa和C33a内circAMOTL1表达量显著增加(P<0.05),miR-379-5p表达量显著降低(P<0.05)。因此选择表达量差异相对较大Caski细胞进行后续实验。见表2。

表2 circAMOTL1和miR-379-5p在宫颈癌细胞中的表达

2.3 敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞增殖的影响 与si-NC组相比,si-circAMOTL1组内circAMOTL1表达量显著降低(P<0.05),48h、72h内OD值显著降低(P<0.05),G0/G1期细胞比例显著上升(P<0.05),S期细胞比例显著降低(P<0.05),CyclinD1、Ki67蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图1,表3。

表3 敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞增殖和周期的影响

2.4 敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞凋亡的影响 与si-NC组相比,si-circAMOTL1组内细胞凋亡率显著上升(P<0.05),Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达显著上升(P<0.05)。见图2,表4。

图2 敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞凋亡的影响;A 凋亡图;B 蛋白图

2.5 circAMOTL1靶向调控miR-379-5p的表达 通过在线数据库预测显示,circAMOTL1和miR-379-5p互补核苷酸序列。为了进一步验证二者间的关系,双荧光素酶报告实验结果显示,与miR-NC组相比,miR-379-5p组内circAMOTL1 WT荧光素酶活性显著降低(P<0.05),circAMOTL1 MUT荧光素酶活性没有显著变化。与pcDNA组相比,pcDNA-circAMOTL1组内circAMOTL1表达量显著上升(P<0.05),miR-379-5p表达量显著降低(P<0.05)。见图3,表5、6。

表4 敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞凋亡的影响

图3 circAMOTL1和miR-379-5p互补核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验

表6 circAMOTL1调控miR-379-5p的表达

2.6 抑制miR-379-5p部分回复敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响 与si-circAMOTL1+anti-miR-NC组相比,si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p组内miR-379-5p表达量显著降低(P<0.05),48 h、72 h内OD值显著上升(P<0.05),G0/G1期细胞比例显著降低(P<0.05),S期细胞比例显著上升(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05),CyclinD1、Ki67、Bcl-2蛋白表达显著上升(P<0.05),Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表7、8,图4。

表7 抑制miR-379-5p部分回复敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞凋亡的影响

表8 抑制miR-379-5p部分回复敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞增殖和周期的影响

图4 抑制miR-379-5p部分回复敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响;A 蛋白图;B 凋亡图

3 讨论

宫颈癌作为常见的恶性肿瘤,虽然宫颈癌的诊断和治疗方法已经取得了进步,但是患者的不良预后、复发是当前治疗的难题[8]。circRNA是新发现的内源RNA,在多种癌症内异常表达,可以作为癌症的潜在生物标记物[9,10]。circAMOTL1位于人染色体11上,在癌症内表达上调,如circAMOTL1在乳腺癌组织内表达上调,通过参与乳腺癌细胞的增殖、凋亡等促进乳腺癌的发展[11]。Liu等[12]研究结果发现,circAMOTL1在口腔鳞状细胞癌内表达上调,circAMOTL1通过调控miR-22-3p/miR-1294促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖。Ou等[13]研究结果发现,circAMOTL1宫颈组织内表达上调,与不良预后有关,抑制circAMOTL1能抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移,并诱导细胞的凋亡,通过调控miR-485-5p/AMOTL1轴发挥在宫颈癌内的作用。以上均说明circAMOTL1在癌症内起到促癌的作用,可以作为宫颈癌的潜在标记物,本研究结果显示,通过qRT-PCR检测宫颈癌组织和细胞内circAMOTL1的表达量,发现circAMOTL1在宫颈癌组织和细胞内表达上调,通过体功能实验观察敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞增殖和凋亡的作用。结果显示抑制circAMOTL1能降低宫颈癌细胞内OD值,增加G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率,减少S期细胞比例,下调CyclinD1、Ki67、Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,说明circAMOTL1在宫颈癌起着促癌的作用,这与上述结果相似。

miR-379-5p属于miR-379家族,在人类癌症中表达异常失调,能参与多种癌症的发生和发展[14,15]。Jiang等[16]研究结果显示,在非小细胞肺癌组织和细胞中miR-379-5p表达下调,miR-379-5p通过靶向β-arrestin-1的表达抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡。在乳腺癌的研究中发现,miR-379-5p在乳腺癌组织内表达下调,LINC00665负调控miR-379-5p的表达抑制乳腺癌细胞的增殖和转移[17]。陈昆等[18]研究结果显示,miR-379-5p在膀胱癌组织和细胞内表达下调,上调miR-379-5p能抑制膀胱癌细胞的增殖和转移。有研究结果显示miR-379在宫颈癌组织和细胞中表达下调,与癌症分期、淋巴结转移和远处转移有关[19],过表达miR-379能抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭。以上均说明miR-379-5p在癌症中表达失常,可以作为多种癌症的标记物,本研究结果发现,miR-379-5p在宫颈癌组织和细胞内表达下调,说明miR-379-5p在宫颈癌中起着抑癌的作用,这与上述结果一致。通过在线数据库预测显示miR-379-5p是circAMOTL1靶基因,qRT-PCR结果显示,过表达circAMOTL1能降低miR-379-5p的表达水平,说明circAMOTL1靶向负调控miR-379-5p。进一步实验结果显示,抑制miR-379-5p可以逆转敲低circAMOTL1对宫颈癌细胞增殖、周期和凋亡的作用,说明circAMOTL1靶向负调控miR-379-5p促进宫颈癌恶性发展。

综上所述,circAMOTL1在宫颈癌组织和细胞内高表达,敲低circAMOTL1能抑制宫颈癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡,并阻滞细胞周期,其作用机制可能与miR-379-5p有关,为宫颈癌的治疗和诊断提供新的靶标。