丙泊酚调控miR-21-3p对缺氧/复氧所诱导心肌细胞损伤的影响

张素冰 赵滨滨 张丹琦

心肌缺血再灌注损伤是一种常见的心血管疾病病理过程,研究表明麻醉药物可减缓心肌缺血再灌注导致的心肌细胞损伤[1,2]。麻醉药物可通过抑制炎性反应及细胞凋亡等过程而减轻缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤[3,4]。丙泊酚是常用的一种静脉麻醉药物,并可广泛用于心血管手术麻醉,研究表明丙泊酚可减轻H/R诱导的海马神经元细胞损伤[5]。但丙泊酚对H/R诱导的心肌细胞损伤的分子机制尚未明确。微小RNA(miRNA)在细胞损伤中可发挥重要调控作用,研究表明,miR-21-3p在大鼠缺血性脑损伤中表达水平升高,抑制其表达可减轻大鼠缺血性脑损伤[6]。然而,miR-21-3p 在 H/R 引起的心肌细胞损伤中的作用机制尚未明确。关于丙泊酚与miR-21-3p调控作用对心肌缺血再灌注损伤尚不清楚,基于此,本研究通过构建体外心肌缺血再灌注损伤模型,探究丙泊酚能否通过调节miR-21-3p表达抑制H/R诱导的心肌细胞损伤。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 反转录、荧光定量PCR试剂盒、miRNA提取试剂盒(齐一生物科技有限公司);LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(美国Invitrogen);miR-NC、miR-21-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-21-3p(广州锐博生物);大鼠心肌细胞H9C2(上海沪震实业有限公司);IL-6、TNF-α、IL-1β检测试剂盒(上海酶联生物);细胞凋亡检测试剂盒、CCK-8试剂(上海抚生实业有限公司);内参GAPDH与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗、兔抗鼠Bax、Bcl-2抗体(美国Abcam)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组:H9C2细胞在37℃、体积分数5% CO2、95% N2培养箱内缺氧处理6 h,更换为含10%胎牛血清的DMEM正常培养基,接着于37℃、体积分数5%CO2培养箱内复氧处理6 h[7],记为H/R组。con组:在37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养H9C2细胞相同时间,不进行任何处理。分别用含有不同浓度(12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)的丙泊酚的DMEM培养基处理24 h[8],然后进行H/R处理,分别记为H/R+低丙泊酚组、H/R+中丙泊酚组、H/R+高丙泊酚组。anti-miR-NC、anti-miR-21-3p用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent分别转染至H9C2细胞,转染成功后进行H/R处理,分别记为H/R+anti-miR-NC组、H/R+anti-miR-21-3p组。miR-NC、miR-21-3p mimics用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent分别转染至H9C2细胞,转染成功后用含有50 μmol/L丙泊酚的DMEM培养基处理24 h,然后进行H/R处理,分别记为H/R+高丙泊酚+miR-NC组、H/R+高丙泊酚+miR-21-3p组。

1.2.2 CCK-8 法检测细胞增殖:将各组H9C2细胞接种于96孔板(1×103细胞/孔),每孔加入10 μl CCK-8溶液,培养2 h后测定吸光度值(OD 450 nm),用酶标仪检测每个孔的浓度。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率:各组H9C2细胞添加预冷PBS洗涤,后弃上清,加500 μl Binding Buffer重悬细胞,按凋亡检测试剂盒指南测细胞凋亡率。

1.2.4 qRT-PCR检测miR-21-3p的表达水平:提取H9C2细胞总RNA,借助紫外分光光度计测RNA浓度。RNA反转录合成cDNA,以cDNA为模板扩增qRT-PCR,反应条件:95℃预变性2 min,95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循环40次。以ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪测miR-21-3p相对表达量。

1.2.5 ELISA法检测IL-6、TNF-α、IL-1β的水平:收集各组H9C2细胞培养上清液,按照试剂盒指南以ELISA法测定TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

1.2.6 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达量:提取细胞总蛋白,以BCA法分析蛋白浓度,于蛋白样品中添加SDS上样缓冲液,经沸水煮10 min后取40 μg蛋白,行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜、封闭2 h,补充Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)一抗、内参GAPDH抗体(1∶2 000)稀释液,4℃孵育过夜,再用稀释的二抗室温孵育1 h,加ECL显影,用ImageJ软件对各条带进行灰度分析。

2 结果

2.1 丙泊酚对缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2损伤的影响 同con组比较,H/R组细胞增殖抑制率、Bax蛋白水平、细胞凋亡率较高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平较低(P<0.05);与H/R组比较,H/R+低丙泊酚组、H/R+中丙泊酚组、H/R+高丙泊酚组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05),且呈剂量依赖性。见图1,表1。

2.2 丙泊酚对缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2中miR-21-3p表达及炎性因子的影响 同con组比较,H/R组miR-21-3p表达升高(P<0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β的水平升高(P<0.05);与H/R组比较,H/R+低丙泊酚组、H/R+中丙泊酚组、H/R+高丙泊酚组miR-21-3p的表达水平降低(P<0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β的水平降低(P<0.05),且呈剂量依赖性。见表2。

2.3 miR-21-3p转染效果的检测 与miR-NC组比较,miR-21-3p组miR-21-3p的表达量升高(P<0.05);与anti-miR-NC组比较,anti-miR-21-3p组miR-21-3p的表达量降低(P<0.05)。见表3。

图1 丙泊酚对缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2凋亡及相关蛋白表达的影响

表1 丙泊酚对缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2损伤的检测 n=9,

表2 丙泊酚对缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2中miR-21-3p表达及炎性因子的检测 n=9,

表3 miR-21-3p表达的检测 n=9,

2.4 抑制miR-21-3p对缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2损伤及炎性因子的影响 与H/R+anti-miR-NC组比较,H/R+anti-miR-21-3p组细胞增殖抑制率、Bax蛋白水平、细胞凋亡率下降(P<0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β降低(P<0.05),Bcl-2蛋白升高(P<0.05)。见表4,图2。

表4 抑制miR-21-3p对缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2损伤及炎性因子的检测 n=9,

图2 抑制miR-21-3p对缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2凋亡及相关蛋白表达的影响;A 蛋白图;B 凋亡图

2.5 miR-21-3p对丙泊酚处理的缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2损伤及炎性因子的影响 与H/R+高丙泊酚+miR-NC组比较,H/R+高丙泊酚+miR-21-3p组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β的水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。见图3,表5。

图3 miR-21-3p对丙泊酚处理的缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2凋亡及相关蛋白表达的影响;A 凋亡图;B 蛋白图

表5 miR-21-3p对丙泊酚处理的缺氧/复氧诱导心肌细胞H9C2损伤及炎性因子的检测 n=9,

3 讨论

心肌细胞凋亡、炎性反应与心肌缺血再灌注损伤有关,如何减轻心肌缺血再灌注损伤成为治疗心血管疾病的关键,麻醉药物可通过抑制心肌细胞凋亡等缓解心肌缺血再灌注损伤[9]。在H/R诱导的心肌细胞损伤中miRNA表达异常,并可通过调控靶基因表达而参与心肌缺血再灌注损伤[10,11]。但miRNA是否可作为麻醉药物治疗心血管疾病的潜在靶点尚未完全阐明。

丙泊酚可减轻高糖诱导的心肌细胞损伤[12]、胃黏膜上皮细胞损伤[13]。本研究结果显示,H/R诱导的心肌细胞增殖能力降低、细胞凋亡能力增强,与既往研究报道结果相似[14],随着丙泊酚浓度的升高,细胞增殖能力得到恢复、细胞凋亡能力得到抑制,说明丙泊酚对H/R诱导的心肌细胞增殖有促进作用,对细胞凋亡有抑制作用。本研究还显示,H/R诱导的心肌细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β的水平升高,与既往研究报道[15]结果相似,丙泊酚能够以浓度依赖性方式降低IL-6、TNF-α、IL-1β水平,提示丙泊酚可抑制H/R诱导的心肌细胞炎性反应。

miR-21-3p在H/R诱导的神经细胞中表达水平升高,抑制其表达可抑制H/R诱导的神经细胞凋亡[16]。miR-21-3p表达下调可减轻急性出血性坏死性胰腺炎大鼠损伤[17]。miR-21-3p表达上调可通过靶向调控MAT2B而促进脑微血管内皮细胞凋亡及炎性反应从而加重血脑屏障损伤[18]。本研究结果表明,H/R诱导的心肌细胞中miR-21-3p的表达水平异常升高,丙泊酚可干扰miR-21-3p表达,抑制miR-21-3p表达可促进H/R诱导的心肌细胞增殖及抑制细胞凋亡、炎性反应,而miR-21-3p过表达可抑制丙泊酚对H/R诱导的心肌细胞增殖、凋亡及炎性反应的影响。

综上所述,丙泊酚可通过下调miR-21-3p表达而促进H/R诱导的心肌细胞增殖及抑制细胞凋亡、炎性反应,miR-21-3p可能作为丙泊酚减轻心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点,但关于其具体作用机制仍需进一步探究。