miR-146a调控JNK信号通路对高氧下肺泡上皮细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

孙伟 何萌萌 邵春芝 宋云超

在临床治疗过程中,大量难治性低氧血症危重患者需要高氧治疗,但是,长期暴露于高水平的氧气会导致急性肺损伤,并可能导致新生儿支气管肺发育不全和成人急性呼吸窘迫综合征[1]。在高氧诱导的急性肺损伤中,高氧可导致肺泡上皮细胞凋亡和坏死[2]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一种由18～22个核苷酸组成的小型非编码RNA,在全身组织和器官中广泛表达。miRNA参与细胞生长、增殖、分化、凋亡、代谢和其他生物过程。根据报道,miR-146a在过氧化氢刺激的Ⅱ型肺泡上皮细胞中低表达,同时检测到细胞凋亡的增加[3]。miR-146a可以减轻烟雾刺激的小鼠炎性反应,调节吸入性肺损伤进程[4]。这些结果提示,miR-146a对肺损伤具有一定的保护作用,但其机制尚未完全明了。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路是高氧肺损伤中的关键传导途径[5],此外,JNK也是miR-146a的下游靶点之一[6]。基于此,本研究探讨miR-146a、JNK信号通路与高氧诱导的肺泡上皮细胞氧化应激和凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 肺泡上皮细胞A549购自美国典型培养物保藏中心,Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培养基购自美国Gibco,miR-146a mimic购自广州RiboBio公司,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、锰(Mn)SOD检测试剂盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒购自南京建成公司,膜联蛋白(Annexin V)V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)细胞凋亡试剂盒购自江苏凯基公司,miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA RT-PCR试剂盒购自北京天根公司。

1.2 细胞培养与实验分组 肺泡上皮细胞A549在RPMI-1640培养基(10%胎牛血清)中培养,生长环境为37℃、5% CO2。当肺泡上皮细胞处于对数生长期时,将其分为Con(对照)组、Model(模型)组、Model+miR-NC组、Model+miR-146a组、Model+miR-146a+Anisomycin组。其中,Model组高氧处理时,培养箱中通入高纯混合气体(3 L/min),包含O2(900 ml/L)和CO2(50 ml/L)[7],保持10 min,之后密闭培养。Model+miR-NC组、Model+miR-146a组分别将miR-NC、miR-146a mimic通过Lipofectamine 2000转染试剂转染至肺泡上皮细胞,24 h后进行高氧处理。Model+miR-146a+Anisomycin组肺泡上皮细胞转染miR-146a mimic并加入10 μmol/L JNK信号通路激活剂Anisomycin,24 h后进行行高氧处理。

1.3 试剂盒检测SOD、MnSOD活性和MDA含量 收集各组肺泡上皮细胞A549上清液,遵循SOD、MnSOD和MDA检测试剂盒的操作步骤,检测氧化应激指标SOD、MnSOD活性和MDA含量。

1.4 Annexin V-FITC/PI双重染色法评估细胞凋亡 收集肺泡上皮细胞A549,经磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)中洗涤2次,然后重新悬浮在结合缓冲液中。然后将AnnexinV-FITC和PI添加到样品中。在室温下于黑暗中孵育15 min,再次用结合缓冲液稀释样品,并在1 h内通过流式细胞仪分析凋亡细胞的百分比。测量Annexin V+/PI-(早期凋亡)和Annexin V+/PI+(晚期凋亡)凋亡细胞之和。

1.5 蛋白质印迹法(Western blot)分析活化的(Cleaved)-天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)、pro-caspase3、磷酸化JNK(p-JNK)表达 肺泡上皮细胞A549用冰冷的PBS洗涤2次,在冰冷的RIPA缓冲液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物,在使用前加入)中裂解10 min。将细胞裂解物在4℃下以12 000 r/min离心10 min,并收集上清液。用二辛可宁酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白测定试剂盒测定上清液的蛋白含量。将蛋白样品的等分试样(30 μg)在12%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离,并印迹到PVDF膜。在室温下用5%(w/v)的脱脂奶粉在PBS中封闭1 h后,用特异的一抗在4℃下过夜探测膜。然后将膜洗涤3次,并在室温下暴露于辣根过氧化物酶偶联的二抗2 h。再次清洗膜3次后,用增强的化学发光(ECL)检测系统观察抗原-抗体条带。所用一抗为艾博抗公司的Cleaved-caspase3(1∶1 000稀释)、pro-caspase3(1∶1 000稀释)、p-JNK(1∶1 000稀释)和对照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(1：1 000稀释)抗体。

1.6 逆转录定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测miR-146a表达 使用TRIzol试剂从肺泡上皮细胞中提取总RNA。RNA的浓度和质量使用Nanodrop ND2000紫外分光光度法进行测量。随后,通过RT从1 μg RNA中获得cDNA,并保存在-20℃下。使用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行miRNA的RT。U6作为内部参照,使用miRNA RT-PCR试剂盒测定miR-146a的表达。使用的引物序列如下：miR-146a 5’-CGGCGGTGAGAACTGAATTCCA-3’(正向)和5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(反向);U6 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(正向)和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)。反应方案包括在95℃初始变性5 min,然后95℃变性10 s,在60℃退火20 s和在72℃延伸10 s(40 cycles)。使用2-ΔΔCt方法计算miR-146a对U6的相对表达。

2 结果

2.1 miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞氧化应激的影响 与Con组相比,Model组、Model+miR-NC组、Model+miR-146a组肺泡上皮细胞中SOD和MnSOD活性降低,MDA含量增加(P<0.05);与Model组或Model+miR-NC组相比,Model+miR-146a组肺泡上皮细胞中SOD和MnSOD活性升高,MDA含量减少,差异有统计学意义(P<0.05);而Model组与Model+miR-NC组肺泡上皮细胞中SOD、MnSOD活性和MDA含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞氧化应激的影响 n=3,

2.2 miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞凋亡的影响 与Con组相比,Model组、Model+miR-NC组、Model+miR-146a组肺泡上皮细胞的凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达水平提高,pro-caspase3蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与Model组或Model+miR-NC组相比,Model+miR-146a组肺泡上皮细胞的凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达水平降低,pro-caspase3蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);而Model组与Model+miR-NC组2组肺泡上皮细胞的凋亡率、Cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1,表2。

图1 miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞凋亡及caspase3蛋白表达的影响;A Western blot检测miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞caspase3蛋白表达的影响;B 流式细胞术检测miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞凋亡的影响

表2 miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞凋亡的影响 n=3,

2.3 miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞中JNK信号通路的影响 与Con组相比,Model组、Model+miR-NC组、Model+miR-146a组降低肺泡上皮细胞内miR-146a的表达水平,而提高p-JNK蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05);Model+miR-146a组肺泡上皮细胞的miR-146a表达水平高于Model组或Model+miR-NC组,p-JNK蛋白表达水平低于Model组或Model+miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组与Model+miR-NC组肺泡上皮细胞中miR-146a、p-JNK蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图2,表3。

图2 miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞中JNK信号通路的影响

表3 miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞中JNK信号通路的影响 n=3,

2.4 JNK信号通路激活剂能逆转miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞氧化应激的影响 与Model+miR-146a组相比,Model+miR-146a+Anisomycin组肺泡上皮细胞的SOD、MnSOD活性降低,MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 Anisomycin逆转miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞氧化应激的影响 n=3,

2.5 JNK信号通路激活剂能逆转miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞凋亡的影响 与Model+miR-146a组相比,Model+miR-146a+Anisomycin组肺泡上皮细胞的凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达水平升高,pro-caspase3蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3,表5。

图3 Anisomycin逆转miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞凋亡及caspase3蛋白表达的影响;A 流式细胞术检测肺泡上皮细胞凋亡的影响;B Western blot检测肺泡上皮细胞caspase3蛋白表达的影响

表5 Anisomycin逆转miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞凋亡的影响 n=3,

3 讨论

高氧引起的急性肺损伤是最难治的疾病之一,迄今为止,其具体机制尚未完全了解。肺泡上皮细胞是高氧的主要靶细胞,其凋亡被认为是高氧诱导的急性肺损伤发病机制的潜在机制[8]。已有报道,抑制肺泡上皮细胞的细胞凋亡可有效降低高氧诱导的大鼠急性肺损伤[9]。因此,肺泡上皮细胞凋亡是高氧诱导的急性肺损伤的关键因素。氧化应激在急性肺损伤的机制中起重要作用。高氧损伤会造成氧化应激,它优先氧化细胞中的心磷脂和其他类型的脂质,这一事件导致细胞凋亡。高氧诱导的肺损伤,尤其是严重的肺上皮细胞死亡,扰乱了肺的正常修复过程,并在浸润性免疫细胞极少参与的情况下促进了纤维化反应[10]。本研究将肺泡上皮细胞暴露于高氧中,发现MDA水平升高,SOD活性降低[11],细胞凋亡增加[12],证实了高氧肺损伤模型的有效建立。

miR-146a被报道与多种病理状况有关,包括肿瘤发展[13,14]、类风湿性关节炎[15]、肺[16]、肾[17]、肝[18]和心血管[19]等疾病。研究表明,miR-146a在大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤中呈低表达,miR-146a介导远端缺血后处理保护肢体缺血再灌注后引起的肺损伤的机制[20]。与健康受试者相比,百草枯中毒引起的肺损伤患者中miR-146a的表达显著降低。模拟转染过表达miR-146a下调了肺巨噬细胞中白介素-6的表达,调节百草枯中毒引起的肺损伤的发生和免疫反应[21]。在博来霉素构建的肺纤维化模型中,小鼠组织中的miR-146a表达降低,miR-146a过表达时转化生长因子β1引起的肺成纤维细胞凋亡被抑制[22]。糖尿病肾病大鼠血清miR-146a低表达,与糖尿病肾病模型中MDA含量呈负相关、SOD活性呈正相关[23]。本研究发现,高氧下肺泡上皮细胞miR-146a的表达水平降低,与前人研究[20]一致。过表达miR-146a后,高氧诱导的肺泡上皮细胞SOD、MnSOD活性、pro-caspase3蛋白水平显著升高,MDA含量、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达水平显著降低,说明miR-146a可以有效减轻高氧诱导的肺泡上皮细胞氧化应激,抑制其凋亡,从而保护肺泡上皮细胞免受高氧损伤。

许多研究报道JNK信号通路与高氧下的肺损伤有关。例如,暴露于高氧的新生大鼠肺损伤模型检测到p-JNK、JNK蛋白表达的升高[24],JNK信号通路被激活,并促进高氧下肺损伤细胞的凋亡[25],本研究观察到相同的结果。此外,miR-146a能够降低高氧下肺泡上皮细胞中p-JNK蛋白表达水平,提示miR-146a发挥保护作用的机制与JNK信号通路有关。此前已有报道指出,miR-146a通过JNK和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路模拟改善创伤性脑损伤[26]。雷公藤红素可以减轻脂多糖诱导的炎症损伤,并通过上调miR-146a使JNK和NF-κB通路失活[27]。长链非编码RNA SNHG16通过竞争性结合miR-146a-5p和CCL5进一步介导JNK和NF-κB途径,调节脂多糖诱导的人肺成纤维细胞WI-38炎症损伤[28]。本实验中,miR-146a抑制JNK信号通路活性,JNK信号通路激活剂Anisomycin能逆转miR-146a对高氧下肺泡上皮细胞氧化应激和细胞凋亡的抑制作用。这些结果表明,miR-146a通过抑制JNK信号通路从而改善高氧下肺泡上皮细胞损伤。

综上所述,miR-146a在高氧下肺泡上皮细胞中低表达,其过表达可以减轻高氧诱导的肺泡上皮细胞氧化应激和细胞凋亡,作用机制与抑制JNK信号通路活性有关,提示miR-146a可能成为肺损伤中基于miRNA疗法的潜在治疗靶点。