纳木错牦牛粪便中纤维素降解菌的鉴定及产酶特征*

李 强,罗 金,阳佳宁,高宏涛,刘 璇,贺建武,2

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南 吉首 416000;2.吉首大学杜仲综合利用技术国家地方联合工程实验室,湖南 吉首 416000)

纤维素是生态圈中最丰富的有机物质,是植物生物量的主要组成部分,但纤维素尤其是木质纤维素中相邻多糖可构成高度有序的结晶序列,难以降解进而影响其高效利用.近年来,相关研究显示食草性动物的消化道及粪便中具有较强纤维素降解功能的微生物菌群[1-4].梁泽毅等[5]认为牦牛常年生活在低压缺氧、严寒、食物匮乏环境中,较其他反刍动物拥有更快的纤维素降解速率,他们系统梳理了不同品种、不同年龄段牦牛瘤胃微生物群落及影响因素.全基因组研究证实了反刍动物牛不含纤维素降解酶的编码基因,理论上只能依赖其瘤胃(后肠)中的微生物进行草料分解,这类瘤胃微生物中编码纤维素降解功能的基因组水平较高,是高效纤维素降解菌筛选的理想目标[6].毛婷等[7]利用刚果红平板染色法结合纤维素酶活性测定从甘肃省牦牛粪便中筛选出了一株Bacilluspumilus菌,该菌能有效降解玉米秸.

本研究拟从高海拔的青藏高原牦牛主产区西藏境内采集牦牛粪便样品,筛选样品中降解纤维素能力较强的菌株,并初步分析其产纤维素降解酶的能力,以期为后续产业化开发提供依据.

1 材料与方法

1.1 粪便采集及预处理

本试验的牦牛生活在西藏纳木错,粪便样品来源为5岁龄健康无腹泻公牦牛的新鲜粪便.用小铲取样直接装入样品袋,带回实验室,置于4 ℃冰箱中保存.

1.2 培养基的制备

富集培养基的制备参考文献[7]的方法,并在其基础上进一步优化：CMC-Na 10 g,酵母粉10 g,KH2PO41 g,NaCl 10 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,牦牛粪浸汁5 mL,加蒸馏水至1 000 mL,自然pH,121 ℃条件下灭菌20 min.

分离培养基为羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基：CMC-Na l0 g,酵母膏1 g,琼脂20 g,加蒸馏水至1 000 mL,在pH值7,121 ℃条件下灭菌20 min后制成分离培养皿,冷却备用.

滤纸条崩解培养基：KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.4 g,(NH4)2SO43 g,酵母粉0.1 g,加蒸馏水至1000 mL,121 ℃条件下灭菌20 min.

产酶培养基：(NH4)2SO42.0 g,KH2PO43.0 g,CaCl20.5 g,FeSO4·7H2O 7.5 mg,MgSO40.5 g,CoCl23.0 mg,ZnSO4·7H2O 2.0 mg,MnSO4·H2O 2.5 mg,加蒸馏水至1 000 mL,在pH值7,121 ℃条件下灭菌20 min.

1.3 纤维素降解菌的筛选

从样品袋中取出牦牛粪便,用灭菌的手术刀剖开并取粪便的中心位置1.0 g样品装入有玻璃珠的90 mL无菌水中,连续振荡30 min混匀.取10 mL菌悬液接入90 mL富集培养基中,在35 ℃,170 r/min恒温条件下振荡培养,每隔72 h取10%(体积比)菌悬液转接至新的富集培养基中培养,连续富集驯化5次.

各处理富集培养液过滤后涂布至CMC-Na培养基,55 ℃下倒置培养2 d.刚果红染色后,挑选透明抑菌圈大的菌落进行四分法画线,直至获得纯培养物.

1.4 纤维素酶活的测定

将初筛得到的菌株接种到产酶培养基中,在55 ℃,200 r/min条件下培养2 d后,于4 ℃,8 000 r/min条件下离心10 min,取其上清液(粗酶液)进行羧甲基纤维素酶(CMCase)活性测定.采用DNS比色法[8]测定滤纸酶(FPase)活性与纤维素内切酶(CMCase)活性,参考Parry等[9]的方法测定外切葡聚糖酶(EGLase)活性与β-葡萄糖苷酶(BGLase)活性.

1.5 不同条件下纤维素降解菌株的产酶特征

考察温度(5,10,15,20,25,30 ℃),发酵时间(1,3,5,7,9,11 d)和初始pH值(2,3,4,5,6,7)3个因素对目标菌株产纤维素降解酶能力的影响.

1.6 纤维素降解菌株的鉴定

采用OMEGA细菌基因组提取试剂盒提取菌株总DNA,以细菌通用引物27F/1492R进行16S rRNA基因扩增,扩增产物送往上海生物工程有限公司测序.测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析,选择同源性高的序列,利用MEGA 7.0软件进行序列比对、剪辑,进而基于Neighbor Joining法构建系统发育树.

2 结果分析

2.1 高效纤维素降解菌的筛选

连续5次富集培养后,通过平板分离纯化获得8株具有纤维素分解能力的菌株(X1～X8),其在CMC-刚果红培养基上水解圈直径(D)与菌落直径(d)如表1所示.8株纤维素降解菌的D/d范围为2.01～6.22.

表1 分离菌株的水解圈及滤纸条崩解情况Table 1 Hydrolytic Zone and Disintegration of Filter Paper Strips of Bacterial Isolates

滤纸条崩解试验结果表明,菌株X1,X2在15 d内崩解效果最好,其余菌株崩解效果不佳,因此将菌株X1和X2确定为本研究的高效纤维素降解菌.

2.2 高效纤维素降解菌的产酶特征

本研究分别测定了菌株X1和X2在实验室环境下分泌的FPase,CMCase,EGLase和BGLase在不同温度(T)、发酵时间(t)和初始pH值范围内的产酶特征(图1),以此来考察菌株在降解纤维素过程中的酶稳定性.

培养温度对两株纤维素降解菌产酶活性的影响见图1.两株高效纤维素降解菌X1和X2在实验室条件下产生4种纤维素酶的相对活性随着温度、培养时间和初始pH值的增加整体呈现出先升高后降低的趋势。随着培养温度升高,X1和X2菌株产生的FPase,CMCase,EGLase和BGLase的相对活性均在9 ℃左右达到最大,之后开始急剧降低.CMCase和EGLase的相对活性在20 ℃后趋于缓慢下降过程,说明这两株降解菌在低温条件下具有较高的酶活.

发酵时间对两株纤维素降解菌产酶活性的影响见图1.在1 ～ 6 d期间,两菌株的4种纤维素酶的酶活快速上升,在5.5 d左右出现最高值,之后酶活开始呈缓慢下降趋势.4种纤维素酶中,CMCase和BGLase的相对活性下降幅度高于其他两种酶.

初始pH值对菌株X1和X2产酶活性的影响见图1.初始pH值为3.9时,FPase的相对活性最高,初始pH值为3.2时,其余3种纤维素酶活性出现最高值.

在实验室环境下,对菌株X1和X2进行了滤纸条崩解测试(图2).测试条件为上述产酶特征试验的最适温度、最适培养时间和最适初始pH值.结果发现,两株纤维素降解菌在初始pH值为4的发酵培养基中,9 ℃恒温条件下培养6 d后实现了滤纸条的完全降解,而对照组X0仅出现纸片泡胀,未出现降解效果.

2.3 降解菌的分子鉴定

纤维素降解菌X1和X2的系统发育分析树如图3所示.基于16S rRNA基因序列的同源性比对和系统发育分析,发现X1,X2与Cronobacter属的C.sakazakii菌和C.muytjensii菌聚类在一起,相似性大于96%.本研究中两株降解菌之间有遗传距离上的差异,可能代表了Cronobacter属的两个菌株,命名为Cronobactersp. X1和Cronobactersp. X2.

图3 基于16S rRNA序列菌株X1和X2的系统发育分析树Fig. 3 Phylogeny Tree of 16S rRNA Sequences for Identification of Strain X1 and X2

3 讨论

高原地区低温胁迫时间较长,牦牛是长期生长在青藏高原的大型食草动物,从其瘤胃、肠道和粪便中寻找低温纤维素降解菌是一个有前途的方向.本研究的牦牛粪便样品采集于西藏纳木错湖边的草场,在实验室环境下,本研究分离筛选获得两株Cronobacter属菌株,两菌株均具有良好的纤维素降解性能,两株降解菌在初始pH值为4的液态发酵培养基中,于9 ℃条件下发酵6 d即可实现滤纸条的完全降解.本研究结果显示,分离得到的两株菌株在低温产纤维素降解酶方面有一定的应用前景.

目前大部分研究分离得到的高效纤维素降解菌以真菌为主[10].本研究从牦牛粪便中筛选得到的两株菌株为细菌,其在液态环境中能通过适宜的参数调控发酵过程中纤维素酶的产生,这有利于提高纤维素降解菌的工业化应用,以及工业化应用中发酵环境的设备标准化、过程自动化和产品质量稳定性.