无创DNA检测对高龄孕妇胎儿染色体非整倍体疾病及染色体拷贝数变异筛查中的临床价值

王 玲,王 珺,高玲霞,王晓红

(空军军医大学唐都医院 妇产科生殖医学中心,陕西 西安710038)

我国新生儿出生缺陷的发生率为6%,相当一部分出生缺陷是染色体变异导致,主要包括染色体非整倍体异常和CNV[1-2],染色体非整倍体异常研究较多,而CNV作为引起出生缺陷的主要遗传因素,近年来越来越受到人们的重视。

2001年我国母婴保健法实施办法及2002 年产前诊断技术管理办法明确规定对高龄孕妇需进行产前诊断[3]。羊水穿刺作为常用的产前诊断项目,准确性高,但存在孕妇术后流产、羊水渗漏、宫内感染等并发症的风险。在临床工作中,因单纯高龄行侵入性产前诊断的孕妇较少[4],很多孕妇愿意选择无创PNA产前检测(NIPT)。而高龄孕妇作为NIPT的慎用人群,其准确性到底如何?本研究对高龄孕妇进行NIPT筛查,筛查高风险的孕妇通过羊水穿刺进一步诊断,通过对比检测结果和随访妊娠结局,探究高龄孕妇DNA无创产前筛查对染色体非整倍体疾病及CNV的预测价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料纳入2015年7月至2022年6月来唐都医院生殖医学中心就诊的、在充分知情同意下自愿参加NIPT的孕12-22+6 周单胎孕妇,所有参加NIPT的孕妇均为非染色体异常患者、1年内未接受过异体输血、移植手术、免疫治疗、非恶性肿瘤患者且胎儿超声检查正常。剔除唐筛高风险以及超声软指标异常孕妇后的12677例孕妇,按照孕妇预产期年龄分组,年龄≥35 岁为高龄组,年龄<35 岁为低龄组。本研究符合赫尔辛基宣言。

1.2 方法

1.2.1NIPT检测 抽取孕妇静脉血10 ml,分离血浆后,采用磁珠法提取血浆中胎儿游离DNA,采用 Illumina NextSeq CN500高通量测序仪对胎儿DNA片段进行测定,结合生物信息学分析,计算出胎儿患染色体非整倍体疾病以及CNV的风险。其中Z在(-3.0～3.0)内为低风险,否则即为高风险。

1.2.2介入性产前诊断 对NIPT 检测高风险的孕妇给予遗传咨询,并建议其进行羊水穿刺,取羊水30 ml,通过羊水细胞染色体核型分析和IonProton高通量测序(NGS)全基因组拷贝数变异分析进行验证。

1.2.2.1染色体核型分析 在37℃条件下5%的二氧化碳培养箱中进行羊水细胞培养,依据人类细胞遗传学国际命名体制(IscN2009)标准进行G显带染色体核型分析。

1.2.2.2羊水细胞染色体高通量测序 将羊水离心,弃上清,按照核酸提取试剂盒说明书提取羊水细胞全基因组DNA,IonProton二代测序技术行染色体拷贝数变异分析。

1.3 观察指标记录所有胎儿的 NIPT 检测结果、妊娠结局以及 NIPT高风险胎儿的介入性产前诊断结果,对比NIPT结果和产前诊断结果,分析NIPT对不同染色体异常类型的PPV、灵敏度和特异度。

1.4 统计学方法采用SPSS17.0软件对数据进行分析。组间率的比较采用χ2检验或fisher确切检验,显著性水准α=0.05。

2 结果

2.1 NIPT检测结果分析

12675例孕妇中,高龄孕妇2093例,低龄10582例。共有染色体高风险孕妇177例(1.40%),其中21三体高风险40例,18三体高风险孕妇13例,13三体高风险7例,性染色体非整倍体高风险91例,CNV高风险孕妇26例。随访结果显示,NIPT对21三体、18三体、13三体、性染色体非整倍体异常以及CNV的筛查中未发现假阴性病例,即阴性预测值为100%,漏诊率为0。

2.2 不同年龄孕妇NIPT对21三体、18三体、13三体的准确性分析

NIPT结果提示21三体高风险孕妇中,低龄组31例,19例孕妇同意进行介入性产前诊断,确诊11例,PPV为57.89%;高龄组9例,6例孕妇同意进行产前诊断,确诊5例,PPV为83.33%,见表1。通过统计学分析,两组间PPV无差异(P=1.000)。NIPT结果提示18三体高风险孕妇中,低龄组8例,5例同意进行介入性产前诊断,确诊2例,PPV为40%;高龄组5例,4例孕妇同意进行介入性产前诊断,确诊2例,PPV为50%。与低龄组相比,高龄组岁孕妇的PPV差异之间无统计学意义(P=1.000)。NIPT结果提示13三体高风险孕妇中,低龄组4例,2例孕妇同意进行介入性产前诊断,确诊1例,PPV为50%;高龄组3例,2例孕妇同意进行介入性产前诊断,确诊0例,阳PPV为0。通过统计学分析,两组间PPV无差异(P=1.000)。

表1 不同年龄孕妇NIPT常染色体非整倍体异常的阳性预测值比较

2.3 不同年龄孕妇NIPT性染色体非整倍体异常的准确性分析

NIPT结果提示性染色体非整倍体高风险孕妇中,低龄组82例,49例孕妇同意进行介入性产前诊断,确诊14例,PPV为28.57%,灵敏度为100.00%,特异度为99.70%;高龄组9例,8例孕妇同意进行介入性产前诊断,确诊3例,PPV为37.5%,灵敏度为100.00%,特异度为99.76%,见表2。两组间PPV差异无统计学意义(P=0.609)。

表2 性染色体高风险孕妇NIPT结果与介入性产前诊断比较

2.4 染色体拷贝数变异在NIPT检测结果与介入性产前诊断结果比较

NIPT结果提示CNV高风险孕妇中,低龄组21例,17例孕妇同意进行介入性产前诊断,确诊7例,PPV为41.18%,灵敏度为100.00%,特异度为99.91%;高龄组4例,4例都进行产前诊断,确诊1例,PPV为25%,灵敏度为100.00%,特异度为99.86%,见表3。与低龄组相比,高龄组孕妇的PPV差异之间无统计学意义(P=0.364)。

表3 CNV高风险孕妇NIPT结果与介入性产前诊断比较

3 讨论

近年来,随着我国社会经济发展,晚婚晚育人口增多以及生育政策的放开,高龄产妇逐渐增多,导致胎儿染色体异常的发生率增加[5],并且高龄孕妇发生不良妊娠结局的概率也明显高于35岁以下孕妇[6]。迄今为止,针对染色体疾病还没有有效的治疗手段。通过产前检测、诊断以及遗传咨询是降低生育染色体疾病患儿风险的最好方法。目前,传统的产前诊断是检测胎儿染色体异常和畸形的金标准,但该技术存在一定的风险,给孕妇本人和家属带来一定的心理压力。而NIPT从1997年香港中文大学卢煜明教授发现孕妇外周血中存在游离的胎儿DNA[7],并发展出了一套准确分析母亲血浆内的胎儿DNA、利用二代测序技术检测唐氏综合征以来,随着处理方法的优化,生物信息学分析流程的完善,该技术越来越成熟,对于胎儿性染色体异常以及染色体微重复微缺失等其他染色体疾病的检测能力和准确性也有所提升[8],被越来越多的人接受。

然而高龄作为NIPT的慎用人群,高龄孕妇与年龄<35岁孕妇之间的各染色体异常的阳性预测值是否有差异,以及高龄孕妇进行NIPT筛查的可行性。本研究表明NIPT 对21三体、18三体、13三体综合征、性染色体非整倍体异常以及CNV的筛查效能在高龄组与低龄组之间无统计学差异。说明NIPT对高龄孕妇的检测效能与年龄<35岁孕妇相当。但是NIPT检测作为一项筛查技术,有其局限性,筛查低风险不等于无风险,孕妇仍需按时进行产前检查(比如胎儿排畸超声等)[9];当结果提示高风险时,一定要告知患者该检测存在误诊以及假阳性的可能,建议患者通过羊穿等技术进行产前诊断。

本研究结果表明NIPT对各染色体异常的阳性预测值是不同的,对21三体的阳性预测值较高,对18-三体、13-三体、性染色体数目异常以及CNV 的检测阳性预测值较低。21-三体、18-三体和13-三体的阳性预测值比国内外报道[10]较低,可能与高风险样本量少有关。随访结果表明,无创DNA检测的漏诊率很低。因此,对于高龄孕妇可应用无创DNA进行染色体非整倍体异常以及CNV筛查,筛查低风险的孕妇随访至妊娠结束,避免漏诊,筛查高风险的孕妇通过羊穿进一步确诊,这种思路是可行的。