抗HER2单抗注射液(皮下注射)的质量控制

杜加亮,于传飞,王文波,武 刚,崔永霏,郭璐韵,梅玉婷,俞小娟,李 萌,王 兰

(中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室,卫生部生物技术产品检定及标准化重点实验室,国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室,北京 102629;#共同第一作者;*通讯作者,E-mail:wanglan@nifdc.org.cn)

人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)可以调节细胞的有丝分裂、增殖和凋亡。HER2阳性乳腺癌是指ERBB2/neu癌基因增加和/或相关HER2跨膜受体蛋白过表达[1]。HER2阳性乳腺癌约占全部乳腺癌的15%～20%,更具侵袭性且预后更差。抗HER2单抗的出现显著改善了患者的预后,可延长晚期胃癌和乳腺癌HER2过表达患者的总体生存率,85%的HER2阳性乳腺癌患者至少可以存活10年[2]。抗HER2单抗虽然有疗效,但仍需辅助化疗才能最大限度提升疗效。抗HER2抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate,ADC)是一种含有抗HER2单抗和细胞毒有效载荷的治疗药物,可以提高肿瘤药物的靶向性、减少毒副作用,进一步提高肿瘤患者的生存时间,如emtansine、deruxtecan和Disitamab vedotin[3]。

皮下注射给药方式已成为生物治疗药物在多种疾病治疗中静脉给药的一种有价值的替代方法。尽管皮下注射制剂和静脉给药制剂的药代动力学特征不同,但皮下注射给药已被证明有效、安全、耐受性良好,在临床上受到患者和医生的关注,并在一定程度上降低了相关的医疗成本和节约了资源[4]。Ⅲ期临床试验结果表明,抗HER2单抗的皮下注射剂型与静脉给药剂型在HER2阳性的早期乳腺癌患者中具有相当的有效性和安全性[5]。此外,单抗类治疗药物由静脉注射剂型向皮下注射剂型的转变还可以获得更高的患者满意度、更低的停药率和更低的成本[6-9]。尤其是从2019年新型冠状病毒肺炎大流行开始,皮下注射治疗优于静脉注射治疗的好处变得明显,前者可自行给药的灵活性和便利性可以提高依从性和治疗效果,也减少了与医院就诊相关的医疗资源负担和潜在的病毒传播[6,9]。

随着皮下注射剂型优势的凸显,将有越来越多的单抗类治疗药物尝试并推广该给药方式。但是由于细胞外基质的限制,对于单抗等大分子来说皮下给药的液体量是有限的,这意味着皮下制剂可能需要多次给药以达到静脉注射给药的剂量。为了解决这一问题,透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)被用作“扩散因子”以增强皮肤细胞外基质的渗透[10]。因此针对配方的改变,有必要对皮下注射用单抗药物进行完整的质量控制研究。

本研究依据国内和国际的相关指导要求[11,12],研究建立针对皮下注射抗HER2单抗的生物学活性、纯度、寡糖图谱、肽图鉴别和透明质酸酶活性检测等方法,针对产品的关键质量属性进行分析和探讨,为该类型单抗药物的质量控制提供依据和指导。

1 材料与方法

1.1 抗HER2单抗和细胞

抗HER2单抗注射液(皮下注射)及其参比品为中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室留存。人乳腺导管癌细胞系BT-474购自美国ATCC公司。

1.2 主要试剂和仪器

AlamarBlue染料、二硫苏糖醇(DTT)、盐酸胍、色谱级甲酸和乙腈,均购自美国ThermoFisher Scientific公司;碘乙酰胺(iodacetamide,IAM)购自美国AMRESCO公司;三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)、一水合磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠均购自美国Sigma公司;谷氨酰胺、胎牛血清、细胞培养基DMEM购自美国Gibco公司;N-糖苷酶F、胰蛋白酶、胞内蛋白酶Lys-C购自美国Promega公司。高效液相色谱仪1260(美国Agilent公司)、Alliance e2695和H-Class(美国Waters公司);PA800 plus毛细管电泳系统(美国Beckman公司);酶标仪SpectraMax M5(美国Molecular Devices公司)。

1.3 抗HER2单抗的肽图鉴别试验

利用基于胞内蛋白酶Lys-C酶切和反相高效液相色谱(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法进行抗HER2单抗的肽图鉴别试验。用超纯水将样品和参比品稀释至5 mg/ml,取200 μl加入776 μl变性缓冲液(含6 mol/L盐酸胍、360 mmol/L Tris、2 mmol/L EDTA)和10 μl DTT溶液(220 mmol/L)混匀,37 ℃水浴30 min。加入14 μl IAM溶液(300 mmol/L)涡旋混匀,37 ℃水浴30 min。使用葡聚糖凝胶G-25柱脱盐,加入1.8 ml消化缓冲液(含25 mmol/L Tris、1 mol/L尿素、1 mmol/L EDTA)洗脱收集。取300 μl洗脱液加入18 μl胞内蛋白酶Lys-C(100 μg/ml),37 ℃水浴5 h,加入6 μl 10% TFA终止反应。采用Agilent 1260 HPLC系统,XBridge C8(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)色谱柱分离。检测条件:流动相A为0.1%的TFA水溶液,流动相B为0.1%的TFA乙腈溶液,进行梯度洗脱(0～5 min,1%流动相B;5～22 min,1%→15%流动相B;22～94 min,15%→34%流动相B;94～115 min,34%→70%流动相B;115～120 min,70%动相B;120～121 min,70%→1%流动相B;121～135 min,1%流动相B),流速1.0 ml/min,上样体积100 μl,进样器温度5 ℃,柱温50 ℃,检测波长214 nm。比较样品和对照品色谱图是否存在差异。

利用基于胰蛋白酶酶切和RP-HPLC法进行抗HER2单抗的肽图鉴别试验。用变性缓冲液(0.4 mol/L Tris-HCl,8.0 mol/L盐酸胍,pH 8.5)将样品和参比品进行100倍稀释。在290 μl稀释后样品中加入10 μl DTT溶液(0.1 g/ml),50 ℃孵育60 min,加入10 μl IAA溶液(0.33 g/ml),室温避光孵育30 min。使用葡聚糖凝胶G-25柱脱盐,加入500 μl消化缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl,pH 7.0)洗脱收集。向洗脱液中加入10 μl胰蛋白酶溶液(0.25 mg/ml),50 ℃孵育18 h,加入50 μl 10%TFA溶液终止反应。采用Agilent 1260 HPLC系统,Phenomenex Jupiter C18(250 mm×4.6 mm,5 μm,300Å)色谱柱分离。检测条件:流动相A为0.1%的TFA水溶液,流动相B为0.08%的TFA乙腈溶液,进行梯度洗脱(0～20 min,0%流动相B;20～90 min,0→25%流动相B;90～91 min,25%→52%流动相B;91～96 min,52%→100%流动相B;96～97 min,100%流动相B;97～105 min,100%→0%流动相B),流速1.0 ml/min,上样体积200 μl,进样器温度6 ℃,柱温25 ℃,检测波长220 nm。比较样品和对照品色谱图是否存在差异。

1.4 抗HER2单抗的纯度分析

利用非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)进行抗HER2单抗的纯度分析。用超纯水将样品稀释至1 mg/ml,取500 μl稀释后样品使用葡聚糖凝胶G-25柱脱盐。加入1 ml标记反应缓冲液,收集洗脱液,完成缓冲液置换。将10 μl染料试剂工作溶液加入190 μl上述洗脱液中混匀,30 ℃孵育30 min完成标记反应。取该混合溶液190 μl,加入使用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(70 ml的85 mmol/L柠檬酸盐缓冲液pH 6.5与400 ml的85 mmol/L磷酸盐缓冲液混合)平衡的葡聚糖凝胶G-25脱盐柱,弃掉洗脱液去除多余染料,再加入0.7 ml柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液并收集洗脱液(即为标记样品)。将50 μl含0.16 mol/L碘乙酰胺的4%(V/V)SDS溶液添加到150 μl标记样品中混匀,70 ℃孵育5 min,上机分析。使用Beckman PA800 plus毛细管电泳系统和氩离子激光器,无涂层毛细管(内径50 μm,总长度31.2 cm,有效长度21 cm)检测。检测条件:进样电压10 kV 10 s,分离电压为15 kV,毛细管温度为40 ℃,样品室温度为20 ℃,激发波长为488 nm,发射波长560 nm。计算主峰峰面积百分比以及片段峰面积百分比。

利用还原CE-SDS进行抗HER2单抗的纯度分析。用处方缓冲液将样品稀释至1 mg/ml,取95 μl加入巯基乙醇5 μl,混匀后70 ℃水浴15 min,冷却至室温后6 000 rpm离心1 min,取80 μl采用Beckman PA800 plus毛细管电泳系统和无涂层毛细管(总长度31 cm,有效长度21 cm)检测。检测条件:分离电压为15 kV,40 min时反转极性,毛细管温度20 ℃,样品室温度20 ℃,检测波长214 nm,计算样品的重链+轻链峰面积百分比。

利用分子排阻色谱(size-exclusion chromatography,SEC)法进行抗HER2单抗的纯度分析。用原液缓冲液将样品稀释至10 mg/ml,取15 μl上机分析。采用Waters e2695高效液相色谱系统配备紫外检测器、TSKgel G3000 WXL色谱柱检测。流动相由0.2 mol/L磷酸钾、0.25 mol/L氯化钾,配制而成,pH为7.0,流速为0.5 ml/min,上样量10 μl,进样器温度6 ℃,柱温为室温,在波长280 nm处检测,计算单体峰的峰面积百分比。

1.5 抗HER2单抗的电荷异质性分析

采用阳离子交换色谱(ion-exchange chromatography,IEC)法进行抗HER2单抗的电荷异质性分析。用原液缓冲液将样品稀释至1 mg/ml,加入1%质量百分比的1 mg/ml溴代十六烷基吡啶(bromohexadecyl pyridine,CpB)溶液,37 ℃孵育20 min。取50 μl上机分析。利用Waters e2695高效液相色谱系统配备紫外检测器和Thermo Fisher ProPac WCX-10 Analytical色谱柱检测。检测条件:流动相A为0.01 mol/L磷酸钠,pH 7.5;流动相B为含0.1 mol/L氯化钠的缓冲液A;进行梯度洗脱(0～30 min,15%流动相B;30～36 min,15%→55%流动相B;36～45 min,55%→100%流动相B;45～55 min,15%流动相B);流速0.8 ml/min;检测波长214 nm;柱温25 ℃;样品室温度6 ℃。计算抗HER2抗体的主要活性成分(峰3*+峰3)和产品相关杂质(峰4)的峰面积百分比。

1.6 抗HER2单抗的寡糖含量分析

采用亲水相互作用液相色谱(hydrophilic inte-raction liquid chromatography,HILIC)法进行抗HER2单抗的寡糖图谱分析。将相当于200 μg单抗的样品溶液用消解缓冲液(10 mmol/L甲酸铵,pH 8.6)在10 kD超滤管中浓缩至48 μl。加入糖苷酶PNGase F 2 μl,45 ℃孵育1 h裂解由天冬酰胺连接的高甘露糖及杂合和复杂的寡糖糖蛋白,12 000g室温离心5 min,收集离心液(寡糖)。加入200 mmol/L乙酸5 μl,45 ℃孵育15 min。在寡糖溶液中加入2-AB标记试剂10 μl,65 ℃孵育2 h,冷却至室温,加入96%乙腈1 ml混匀,移入二醇纯化柱通过重力作用使寡糖吸附于柱芯,使用100 μl 20%乙腈洗脱聚糖(2 300g,2 min)。将洗脱后的聚糖溶液与96%乙腈按1∶1(V/V)混合后上机检测。色谱条件:流动相A为50 mmol/L甲酸铵(pH 4.5),流动相B为乙腈,进行梯度洗脱(0～31.5 min,75%流动相B;31.5～32.0 min,75%→64.8%流动相B;32.0～35.0 min,64.8%→0流动相B;35.0～36.0 min,0流动相B;36.0～40.0 min,0→75%流动相B;40.0～47.5 min,75%流动相B)。使用Waters H-Class超高效液相色谱仪,荧光检测器进行分析,检测器激发波长330 nm,发射波长420 nm,色谱柱为Waters Acquity BEH聚糖色谱柱(2.1 mm×150 mm,1.7 μm);进样体积为10 μl,柱温60 ℃,自动进样器温度10 ℃。计算αFuc、G2和Man5的面积百分比。

1.7 抗HER2单抗的透明质酸酶含量测定

用酶稀释液将rHuPH20标准品稀释至81.2 U/ml,按照1∶2.5倍比稀释5个稀释度。用酶稀释液将样品稀释至9.31,7.00,4.65 U/ml。在96孔黑色/透明底部微孔板中加入0.70 mg/ml HA底物溶液(30 μl/孔),再次加入稀释后的标准品和样品(30 μl/孔),60 ℃孵育30 min。在冰浴中冷却反应板2 min。加入血清工作溶液(240 μl/孔)终止反应,在640 nm波长下读取吸光度。使用SoftMax Pro软件,绘制吸光度值相对于rHuPH20标准品活性的散点图,并进行五参数logistic拟合非线性回归。将样品稀释液的活性乘以其各自的稀释倍数,以U/ml为单位计算原始样品的活性。

1.8 细胞增殖抑制试验测定抗HER2单抗的生物学活性

对数生长期的BT474人乳腺癌细胞经胰酶消化后,用培养基调节细胞密度至1.0×105个/ml,以100 μl/孔加入96孔板,置5% CO2培养箱37 ℃孵育1～3 h。期间用培养基将参比品稀释9个浓度,分别为1 000,700,450,300,200,130,90,40,20 ng/ml,同时用培养基将样品稀释4个浓度,分别为450,300,200,130 ng/ml。将稀释后的参比品/样品加于96孔板中,100 μl/孔,设双复孔,置5% CO2培养箱37 ℃孵育110～120 h。加入阿尔玛蓝(alamarBlue)染液25 μl/孔,37 ℃孵育6～8 h,在530 nm和590 nm读取吸光度。利用双平行线法计算样品的相对效价。可接受标准为:参比品剂量反应曲线的R2应≥0.90,样品和参比品的斜率比应为0.80～1.25。

1.9 抗HER2单抗蛋白质含量检测

采用紫外分光光度计法检测抗HER2单抗蛋白质含量,用制剂缓冲液将抗HER2单抗样品稀释至约0.5 mg/ml,紫外分光光度计测定吸光度值(A280和A320),按下述公式计算,蛋白质浓度(mg/ml)=(A280-A320)/E×稀释因子,此处消光系数E=1.5 ml/(cm·mg)。

2 结果

2.1 抗HER2单抗的肽图鉴别结果

实验结果表明,无论使用胰蛋白酶,还是蛋白酶Lys-C酶切,抗HER2单抗经RP-HPLC分离后的色谱图均与参比品的特征图谱具有可比性(见图1),可以发挥良好的鉴别作用。

A.基于胰蛋白酶酶切和RP-HPLC法的肽图图谱B.基于胞内蛋白酶Lys-C酶切和RP-HPLC法的肽图图谱

2.2 抗HER2单抗的纯度分析结果

还原CE-SDS分析表明,抗HER2单抗参比品的重链+轻链峰面积百分比为(98.63±0.14)%,6次实验的RSD值为0.14%(见图2)。非还原CE-SDS分析表明,抗HER2单抗参比品6次实验的主峰和前峰(1～5)峰面积百分比分别为(98.20±0.11)%和(1.47±0.04)%,其RSD值分别为2.72%和0.11%(见图2)。SEC分析表明,抗HER2单抗的主峰峰面积百分比为(99.82±0.05)%,6次实验的RSD值为0.05%(见图3)。

图2 抗HER2单抗纯度的还原CE-SDS和非还原CE-SDS分析图谱

图3 抗HER2单抗纯度的SEC分析图谱

2.3 抗HER2单抗的电荷异质性分析结果

还原CE-SDS分析表明,抗HER2单抗参比品的特征峰峰3*+峰3面积之和百分比为(75.01±0.04)%,6次实验的RSD值为0.05%;峰4的峰面积百分比为(6.72±0.03)%,6次实验的RSD值为0.45%(见图4)。

峰3*+峰3:抗HER2抗体的主要活性成分;峰4:成分产品相关杂质

2.4 抗HER2单抗的寡糖图谱分析结果

寡糖图谱分析结果表明,aFuc、G2和Man5的面积百分比分别为(9.20±0.01)%,(6.33±0.02)%和(1.92±0.01)%(见图5),6次实验的RSD值分别为0.11%,0.32%和11.80%。

红色三角号表示每个色谱峰的积分起始时间点

2.5 抗HER2单抗的透明质酸酶含量分析结果

透明质酸酶标准品测定所得数据符合五参数方程式:Y=(A-D)/[(1+(X/C)B)G]+D,见图6。抗HER2单抗样品的吸光度值代入上述方程后计算得到透明质酸酶含量为(2 021.02±238.41)U/ml,6次实验的RSD值为11.80%。

图6 透明质酸酶标准品的剂量反应关系(五参数曲线)

2.6 抗HER2单抗的生物学活性分析结果

参比品生物学活性测定所得数据符合四参数方程式:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D,即在半对数坐标上呈现典型的S型曲线(见图7)。参比品和样品在450,300,200,130 ng/ml 4个浓度的检测数值呈现明显的平行性(P=0.854,Softmax pro软件自动计算,见图8)。抗HER2单抗的生物学效价为(1.08±0.07)%,6次实验的RSD值为6.61%。参比品曲线R2=0.989,样品与参比品的斜率比均在0.80～1.25之间(1.01±0.08,RSD为8.25%),符合可接受标准。

图7 抗HER2单抗参比品生物学活性测定剂量反应曲线

图8 抗HER2单抗和参比品的生物学活性平行性分析

2.7 抗HER2单抗的蛋白含量测定结果

紫外分光光度法测得的抗HER2单抗注射液(皮下注射)的蛋白浓度为(115.60±0.45)mg/ml,6次实验的RSD值为0.39%。

3 讨论

乳腺癌中HER2的过表达导致同源二聚化(HER2∶HER2)和异源二聚化(如HER2∶HER3)增加,从而引发强烈的促肿瘤发生信号级联反应[13]。根据这一机制,本研究采用高表达HER2的人乳腺导管癌细胞系BT-474[14]构建了基于细胞增殖抑制的抗HER2单抗生物学活性检测方法。抗HER2单抗通过与受体的细胞外结构域结合,抑制过度表达HER2细胞增殖的能力,其特异性生物活性测定方法就是根据这一机制设计的[15]。通过氧化还原染料alamarBlue的颜色和荧光变化来测量对增殖的抑制,当被活细胞吸收时,细胞内代谢减少将其转化为高荧光的红色产物,通过样品和参比品的剂量-效应曲线实现定量。

HAase是一组催化透明质酸(hyaluronic acid,HA)降解的糖苷酶。人HAase PH20(hPH20)由于能有效水解富含透明质酸的基质和低免疫原性等优点,在医学领域得到广泛应用[16]。HAase的活性测定有多种方法。本研究采用基于透明质酸与酸化血清结合时形成不溶沉淀物的原理来测定HAase。通过将供试品与透明质酸温育,随后加入酸化血清沉淀未消化的透明质酸来测定。测定由此产生的浊度,而透明质酸底物的酶解导致的浊度下降是测定HAase活性的量度[17]。该方法基于rHuPH20对照品稀释液的浊度结果生成标准曲线。校准曲线是通过对这些浊度结果进行非线性回归分析,使用五参数Logistic方程拟合生成的。

蛋白一级结构即氨基酸的组成和序列是决定蛋白质功能的重要性质之一。在单抗药物的一级结构分析以及特异性鉴定中,肽图分析发挥着至关重要的作用。胰蛋白酶和胞内蛋白酶Lys-C可以酶解二硫键完全打开并呈现游离伸展状态的抗体分子[18],使用RP-HPLC分析酶解后的小肽段。由于不同单抗氨基酸成分的差异,经肽图分析后表现为不同的特征图谱,结合序列分析可以对其进行精确鉴别。在最终产品的质量控制中,肽图分析也可以作为验证工艺稳定性的重要指标[19,20]。

单抗的蛋白质性质使其对各种物理和化学条件高度敏感,从而导致物理和化学的不稳定性[21]。因此从开发的早期阶段到整个产品生命周期都需要对纯度进行控制,以研究产品降解途径并优化工艺条件。其中,CE-SDS技术能够对主要成分及片段和聚体进行区分[22]。本研究利用还原CE-SDS控制其主要成分(重链和轻链总和),同时利用非还原CE-SDS对不完整抗体(非共价键连接的片段,即低分子量物质)的限度进行了控制。但是由于聚体的含量极少,故无需对其进行限度的控制。另外,本研究在非还原CE-SDS方法中用到了LIF检测器,与传统的紫外检测器相比具有更高的灵敏度[23]。

治疗性单抗的N-糖基化是从共翻译步骤开始的,随后是一组翻译后修饰。由于其对生物学功能和治疗结果的影响而被认为是关键质量属性之一[24]。然而,这些N-连接寡糖的结构复杂性和异质性使得它们的表征非常具有挑战性。本研究使用肽N-糖苷酶F(PNGase F)酶促释放抗HER2单抗的N-连接聚糖[25],经2-氨基苯甲酰胺(2-AB)进行标记后,采用HILIC-UHPLC分离2-AB-标记的聚糖并通过荧光进行检测[26]。

如前所述,单抗皮下给药的液体量是有限的,为了达到治疗效果,必须通过增加蛋白浓度的方式来解决。本研究中的HER2单抗注射液(皮下注射)的蛋白浓度(≈116 mg/ml)约为静脉注射剂型的6倍[27]。虽然高浓度的抗体会导致免疫原性、耐受性和安全性等问题[28],但是多个临床试验的数据表明,高浓度的单抗皮下注射剂型均具有可接受的安全性[29,30]。

综上所述,本研究针对抗HER2单抗注射液(皮下注射)的关键质量属性,研究并建立了相应的质量控制方法,以确保其安全、有效和质量可控,为皮下注射用单抗产品的质量控制方法和策略提供参考依据。