hsa_circRNA_0002141靶向miR-217影响口腔癌进展的分子机制研究

宿伟鹏, 赵化荣, 李晨曦, 刘 攀, 张 洋, 龚忠诚

(新疆医科大学第一附属医院1肿瘤中心, 2(附属口腔医院)颌面肿瘤外科, 3新疆维吾尔自治区口腔医学研究所, 乌鲁木齐 830054)

口腔癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤,每年新确诊病例超过30万,其中口腔鳞状细胞癌占90%以上,5年生存率仅为40%～60%[1]。若在早期进行干预,口腔癌患者的5年生存率可达80%以上,然而,大约50%的口腔癌患者在出现明显症状如疼痛、出血或口腔和颌面部肿块时已被诊断为晚期[2-3]。晚期口腔癌患者的治疗费用不仅高昂,而且预后极差。由此可见,口腔癌的早期诊断与预后密切相关,因此,寻找早期诊断标志物和靶点是当前口腔癌研究的重点。

环状RNA(circRNA)是内源性非编码RNA,具有组织特异性和结构稳定性的特点。与传统线性RNA相比,circRNA是通过反向剪接产生的共价闭合环,没有5′-cap或3′-poly(A)尾结构[4]。目前,多项研究指出,circRNA在各种肿瘤组织与肿瘤细胞中异常表达,如宫颈癌、肝癌、胰腺癌、肺癌等,在调节肿瘤进展方面起着重要作用[5-8]。目前,关于hsa_circ_0002141的研究报道相对较少,有研究指出hsa_circ_0002141在口腔鳞状细胞癌组织和细胞系中的表达水平均显著升高[9],这提示其异常高表达可能与该肿瘤的发生发展相关。circRNA通过与miRNA的竞争性结合发挥其在肿瘤中的作用功能,进而调节肿瘤中的基因表达。miR-217是一种广泛表达的miRNA,已知其在多种肿瘤类型中充当肿瘤抑制基因[10],但其在口腔癌中作用尚未有相关研究报道。本研究以口腔癌细胞为研究对象,检测细胞系中hsa_circ_0002141与miR-217的表达水平,通过抑制或过表达hsa_circ_0002141后观察口腔癌细胞增殖、迁移和侵袭的变化,探讨hsa_circ_0002141与miR-217之间可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂人口腔鳞状细胞癌HSC3、SAS、SCC15、FaDu细胞和人正常口腔角质形成HNOK细胞购于美国菌种保藏中心。胎牛血清(杭州四季青公司),青霉素-链霉素双抗液与DMEM培养液(美国invitrogen公司),Trizol试剂盒和LipofectamineTM2000试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司),反转录试剂盒与荧光定量测定试剂盒(日本Takara公司),双荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海翌圣生物公司),CCK-8增殖检测试剂盒(北京索莱宝生物公司),EdU细胞增殖检测试剂盒(广州市锐博生物公司),DAPI染料和结晶紫染料(上海碧云天生物研究所),Transwell小室和Matrigel胶(美国Corning公司),si_NC、si_circ_0002141、pc_NC、pc_circ_0002141、miR-NC、miR-217 mimic、circRNA_0002141野生型载体及突变型载体构建均交由上海生工生物工程公司设计合成。

1.2 方法

根据上文的表述，目前国内高管薪酬各个部分的比例不当，缺乏长期的激励，这容易引起高管人员的短期行为和利己行为，对于企业长期健康的发展十分不利。而恰当有效的长期激励不仅可以使高管人员注重于企业和个人的双赢发展，也可以使高管人员在风险管控方面更加谨慎、仔细。

1.2.1 细胞培养 将冻存的人口腔鳞状细胞癌HSC3、SAS、SCC15、FaDu细胞和人正常口腔角质形成HNOK细胞复苏,添加含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液,置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养, 直到细胞生长至约70%～80%融合,进行传代培养。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链式反应 在各组细胞中加入Trizol溶液,按照试剂盒说明书提取总RNA,微量核酸蛋白仪检测RNA纯度、浓度。调整提取的RNA样品浓度,利用逆转录试剂盒进行反转录合成cDNA后,使用Primer Premier5.0软件设计引物,根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书配制反应体系,在实时荧光定量PCR系统上测定hsa_circ_0002141与miR-217的表达水平,以U6作为内参基因。扩增结束后,计算各组相应mRNA相对表达量,待测样本mRNA相对表达量=2-△△Ct,实验重复3次。引物序列如下: hsa_circRNA_0002141,上游引物5′-TATGCAGTTAAAAATATACA-3′,下游引物5′-GATCGGACACGGGTCTT-3′;miR-217,上游引物5′-TACTCAACTCACTACTGCATCAGGA-3′,下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′; U6,上游引物5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAAC-3′,下游引物5′-GCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-CCTTGC-3′。

1.2.3 双荧光素酶报告基因检测 通过CircInteractome在线工具预测hsa_circRNA_0002141与miR-217之间是否存在互补结合位点,根据预测结果,构建circRNA_0002141的野生型载体(circ_0002141 WT)和突变型载体(circ_0002141 MUT),按照脂质体法将构建的报告基因质粒分别与miR-NC或miR-217 mimic转染至SAS细胞内,转染48 h后,利用双荧光素酶试剂盒检测转染后细胞中的荧光素酶活性。

小儿推拿学的生理特点主要有脏腑娇嫩、形气未充——五脏六腑稚阴稚阳、元气不足—脾气、肺气、肾气不足，心肝有余；生机勃勃，发育迅速；发病容易，转化迅速；脏气清灵，易趋康复。可预防治疗常见病，包括：小儿泄泻、呕吐、食积、厌食、便秘、腹痛、脱肛、感冒、咳嗽、哮喘、发热、遗尿、夜啼、肌性斜颈、落枕、惊风等疾病，都有较好的效果。

1.2.4 实验分组与转染 将生长状态良好的SAS细胞分为对照组、si_NC组(转染si_NC)、si_circ_0002141组(转染si_circ_0002141)、pc_NC组(转染pc_NC)、pc_circ_0002141组(转染pc_circ_0002141)、pc_circ_0002141+miR-NC组(共转染pc_circ_0002141与miR-NC)、pc_circ_0002141+ miR-217 mimic组(共转染pc_circ_0002141与miR-217 mimic),各组细胞均采用LipofectamineTM2000试剂盒进行转染,严格根据说明书操作。转染结束后,通过实时荧光定量聚合酶链式反应测定转染效果,收集转染成功的细胞,用于后续实验。

2.2 抑制或过表达hsa_circ_0002141对SAS细胞增殖能力的影响对各组SAS细胞增殖活性进行检测发现,在培养24、48、72 h时,与对照组比较,si_circ_0002141组各时间点细胞增殖活性显著下降(P<0.05),而pc_circ_0002141组各时间点细胞增殖活性显著升高(P<0.05),见图2A。经EdU染色后,与对照组比较,si_circ_0002141组EdU阳性率显著降低(P<0.05),pc_circ_0002141组EdU阳性率显著升高(P<0.05),见图2B、2C。

1.2.7 Transwell实验 在迁移实验检测中,将转染后的SAS细胞采用无血清的DMEM培养基调整浓度,制成2×105个/mL的悬液,在Transwell下室加500 μL含血清的新鲜培养基,上室加入100 μL细胞悬液。将小室置于细胞培养箱内培养24 h,取去小室,棉签擦掉未迁移细胞,经过多聚甲醛固定、结晶紫染色,封片,晾干,在光学显微镜下观察细胞迁移数目并拍摄图像,随机选择6个视野,计数该视野下迁移数目。侵袭实验中,首先将稀释的Matrigel胶铺在Transwell 上室底部,并置于37℃培养箱形成基质层,后续步骤同迁移实验。

1.2.6 EdU染色 将转染后的SAS细胞调整密度至1×105个/mL,取100 μL接种至96孔板,在孔内加入10 μmol/L EdU试剂,室温孵育2 h,PBS清洗,再加入Apollo488避光染色30 min,接着以Hoechst避光染色30 min,PBS清洗,封片,晾干,通过激光共聚焦显微镜观察着色细胞并拍摄图像,每张切片随机选择6个视野,计数该视野下EdU阳性细胞数与总细胞数,统计EdU阳性率,具体公式为:EdU阳性率(%)=EdU阳性细胞数/总细胞数×100%。

2.5 过表达miR-217对SAS细胞增殖的作用经检测各组SAS细胞在培养24、48、72 h时的增殖活性发现,与对照组比较,pc_circ_0002141组细胞各时间点增殖活性显著升高(P<0.05),与pc_circ_0002141组比较,pc_circ_0002141+miR-217 mimic组细胞各时间点增殖活性显著降低(P<0.05),见图5A。EdU染色结果显示,pc_circ_0002141组EdU阳性率显著高于对照组(P<0.05);而pc_circ_0002141+ miR-217 mimic组EdU阳性率显著低于pc_circ_0002141组(P<0.05),见图5B、5C。

(2)建议糖尿病患者炒菜时使用含不饱和脂肪酸的植物油,忌食动物脂肪,以减少饱和脂肪酸的摄入;一些胆固醇含量较高的食物,如动物内脏、鱼子、蛋黄等,一定要少吃或者不吃。

2.3 抑制或过表达hsa_circ_0002141对SAS细胞迁移与侵袭的影响Transwell实验检测结果显示,si_circ_0002141组SAS细胞迁移数目与侵袭数目均显著低于对照组(P<0.05),pc_circ_0002141组细胞迁移数目与侵袭数目则显著高于对照组(P<0.05),见图3。

2 结果

2.6 过表达miR-217对SAS细胞迁移与侵袭的影响通过Transwell实验检测发现,与对照组比较,pc_circ_0002141组SAS细胞迁移数目与侵袭数目均显著增加(P<0.05),与pc_circ_0002141组比较,pc_circ_0002141+miR-217 mimic组细胞迁移数目与侵袭数目均显著减少(P<0.05),见图6。

注: A, 各细胞内hsa_circ_0002141表达比较; B, 各细胞内miR-217表达比较。 与HNOK比较, *P<0.05。

1.2.5 CCK-8法 将转染后的SAS细胞调整密度至1×105个/mL,取100 μL接种至96孔板,置于37℃、5%CO2培养箱内培养,分别在0、24、48、72 h时,通过CCK-8法检测细胞增殖活性。将CCK-8试剂与培养基混合进行稀释,取适量稀释后的溶液加入细胞孔中,在培养箱继续孵育2 h,利用酶标仪在450 nm处测定各孔吸光度(OD)值,细胞增殖活性与OD值呈正比。

2.2 术前创面处理 给予暴露疗法，支被架支撑，屏风遮挡保护患者隐私。协助医师做好术前伤口换药:双氧水冲洗创面、0.02%聚维酮碘溶液消毒，每日1次。磺胺咪隆溶液湿敷创面，每日4次，头孢菌素类抗生素和左氧氟沙星抗炎治疗。

注: A, CCK-8法检测细胞增殖活性; B, EdU染色观察细胞增殖水平; C, EdU阳性细胞统计结果。 与对照组比较, *P<0.05。

注:与对照组比较, *P<0.05。

2.4 hsa_circ_0002141与miR-217相互作用的鉴定CircInteractome在线工具预测发现hsa_circ_0002141与miR-217之间存在互补靶向结合位点,见图4A。双荧光素酶报告基因检测结果显示,与miR-NC组比较,circ_0002141 WT组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05),见图4B。

注: A, CircInteractome软件预测hsa_circ_0002141与miR-217靶向结合位点; B, 双荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性。 与miR-NC组比较, *P<0.05。

根据工程场地上的孤石，经过研究将孤石的赋存形态分为：叠加型、完全出露型、部分埋入型、全部埋入型四大类。

注: A, CCK-8法检测细胞增殖活性; B, EdU染色观察细胞增殖水平; C, EdU阳性细胞统计结果。 与对照组比较, *P<0.05; 与pc_circ_0002141组比较, #P<0.05。

2.1 hsa_circ_0002141与miR-217在人口腔鳞状细胞癌细胞中的表达qRT-PCR检测结果显示,相较于人正常口腔角质形成HNOK细胞,hsa_circ_0002141在人口腔鳞状细胞癌HSC3、SAS、SCC15、FaDu细胞中均显著上调(P<0.05);miR-217在HSC3、SAS、SCC15、FaDu中的表达水平显著低于HNOK中的表达水平(P<0.05),见图1。

注:与对照组比较, *P<0.05; 与pc_circ_0002141组比较, #P<0.05。

3 讨论

本研究经检测发现,在人口腔鳞状细胞癌HSC3、SAS、SCC15、FaDu细胞中hsa_circ_0002141表达水平显著上调而miR-217表达水平则显著下调,过表达hsa_circ_0002141能够促进SAS细胞增殖、迁移和侵袭,抑制其表达作用效果则相反,并证明了hsa_circ_0002141与miR-217存在靶向关系,提高miR-217表达能够消除过表达hsa_circ_0002141对SAS细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用,这为口腔癌的特异性靶向治疗方法提供实验基础与参考依据。

circRNA是稳定的RNA分子,通过与其他分子相互作用,以调节基因表达从而参与多种生物学过程或包括肿瘤在内的病理反应[11]。越来越多的研究表明,circRNA在口腔癌中发挥重要作用。例如,circUHRF1(circ_0002185)作为口腔鳞状细胞癌细胞中新鉴定的一种circRNA,在该肿瘤组织及细胞中表达上调,其过度表达与口腔鳞状细胞癌患者的不良预后密切相关,此外,在功能上circUHRF1能够促进口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化以及体内肿瘤生长[12];circPVT1(circ_0001821)在口腔鳞状细胞癌细胞和肿瘤样本中表达上调,敲低其表达后该肿瘤细胞增殖受到抑制[13];circ-100290在20例口腔鳞状细胞癌肿瘤样本及肿瘤细胞系Tca8113、CAL27中均过表达,沉默circ_100290表达后促进了肿瘤细胞凋亡,并抑制细胞集落形成能力,减少了乳酸产生[14]。据报道[9],hsa_circ_0002141过表达能够促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,同时降低了细胞凋亡。本研究同样发现,hsa_circ_0002141在口腔鳞状细胞癌HSC3、SAS、SCC15、FaDu细胞中的表达水平均显著上调,抑制其表达可降低细胞增殖,减少细胞迁移或侵袭数目,而过表达hsa_circ_0002141则促进了细胞增殖、迁移及侵袭。

miRNA是一种长度为18～22个核苷酸的短非编码RNA,通过与靶mRNA碱基配对,在转录后作为基因沉默序列特异性负调控因子表达发挥作用,从而导致mRNA切割或翻译抑制[15]。现已知,miR-217作为肿瘤抑制因子在多种肿瘤进展中发挥作用,例如,miR-217可通过调节SIRT1和P53/KAI1信号通路抑制非小细胞肺癌的细胞增殖、迁移和侵袭[16];在胃癌中miR-217通过靶向PTPN14抑制肿瘤细胞上皮间质转化[17];miR-217通过调节MAPK1表达水平抑制宫颈癌细胞系HeLa的迁移和侵袭[18];miR-217在卵巢癌细胞中通过靶向IGF1R来发挥肿瘤生长抑制作用[19]。然而,miR-217在口腔癌中的作用仍需进一步研究。

1963年11月22日，毛泽东同志对在社会主义教育运动中诸暨枫桥干部群众创造的“在党的领导下，发动和依靠群众，坚持矛盾不上交，就地解决，实现捕人少、治安好”[1]101的经验，亲笔做出批示，“要各地仿效，经过试点，推广去做”[1]101。从此，“枫桥经验”成为全国政法综治战线的一面旗帜。50年来，绍兴各级党委、政府始终坚持“枫桥经验”的基本精神不动摇，并紧跟时代发展步伐，不断丰富和发展“枫桥经验”。50年的实践充分证明，“枫桥经验”是践行党的群众路线的鲜活“样本”，是预防化解社会矛盾的一颗“常青树”，是推动科学发展的一笔宝贵财富，使其在新时期愈发呈现出蓬勃的生机和旺盛的活力。

circRNA来源于RNA转录酶II的前体mRNA,不易被核酸外切酶RNase R降解,主要通过各种功能机制发挥转录和转录后调节的作用。circRNA含有大量的miRNA结合位点,具有miRNA海绵作用,进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。同时circRNA也可以通过与RNA结合蛋白的结合来调控蛋白功能,例如通过与转录因子的结合来抑制基因的转录[20-21]。本研究通过生物信息学在线工具预测到miR-217与hsa_circ_0002141存在靶向互补结合位点,并在SAS细胞中通过双荧光素酶报告基因测定实验进行了验证,证实了miR-217靶向负调控hsa_circ_0002141表达。此外,相较于单独过表达hsa_circ_0002141,在SAS细胞中同时过表达miR-217和过表达hsa_circ_0002141后,细胞增殖、迁移及侵袭均受到抑制,提示hsa_circ_0002141/miR-217轴可能参与了口腔癌的肿瘤进展。

综上所述,本研究证实hsa_circ_0002141调控口腔鳞状细胞癌SAS细胞的增殖、迁移及侵袭,其作用机制可能与靶向吸附miR-217有关,这为口腔癌的诊疗和预后提供了潜在的候选靶标。然而,后续还需进行体内实验研究,并将基础实验与临床数据相结合,进一步探索circRNA在口腔癌治疗中的可行性,从而为提高临床患者疗效开辟新的途径。