基于网络药理与分子对接探讨资生汤治疗COPD潜在分子机制

徐雨辰 叶旭星

1.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053；2.浙江大学医学院附属金华医院传统医学中心，浙江金华 321000

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种慢性炎症性致残性疾病[1]，发病率和病死率都较高，已成为死亡的主要原因[2]。慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）是COPD 进展的关键[3]。中医药对COPD 具有预防急性加重和治疗的积极作用[4]。中医学将COPD 归属于“肺胀”“咳嗽”“喘证”等范畴[5]，本虚标实为其主要病理特征。资生汤出自张锡纯《医学衷中参西录》载：“资生汤主治劳瘵羸弱已甚，饮食减少，喘促咳嗽……。”[6]本方为虚损性疾病而设，从“虚”入手，取“补土生金”之意。研究表明资生汤可以提高COPD 患者免疫功能及生活质量[7]。但其具体有效成分、作用靶点等尚未见有报道。因此，本研究采用网络药理学及分子对接方法探讨资生汤治疗COPD 的潜在分子机制，为临床提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资生汤有效成分提取

将资生汤药物组成“山药、白术、玄参、牛蒡子”4 味中药（鸡内金由于非草本类药物无数据资料，故不纳入）分别输入中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP（traditional chinesemedicine systems pharmacology，https://tcm-spw.com /tcmsp.php），将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）设置为≥50%及药物相似性（drug-likenes，DL）设置为≥0.20，最终合并以获得活性成分数据集。

1.2 资生汤药物作用靶点挖掘

同样利用TCMSP 数据库收集资生汤有效活性成分对应的作用靶点，然后运用UniProt（https://www.uniprot.org/）数据库进行作用靶点匹配及基因名标准化处理以用于网络结构分析。

1.3 资生汤治疗COPD的潜在作用靶点筛选

以“COPD”作为搜索条件输入GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，收集得到慢性阻塞性肺疾病靶点。运用Venn 图在线工具（https://www.bioinformatics.com.cn/）提取疾病靶点和药物作用靶点的交集，即得到资生汤治疗COPD 的潜在作用靶点。

1.4 蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

将资生汤治疗COPD 潜在作用靶点数据集上传至String 数据库（https://string-db.org/），导出蛋白质相互作用网络数据信息。再利用Cytoscape 3.8.2软件构建PPI 网络图。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

利用David 6.8 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），对潜在作用靶点进行基因本体和通路富集分析，并进行数据可视化处理。

1.6 分子对接

从TCMSP 数据库下载资生汤有效成分分子式作为配体，从PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）下载关键靶点蛋白，去除水分子及配体，作为受体。运用AutoDock Vina 1.2.3 软件对筛选所得的配体及受体逐个进行批量分子对接以验证结合能力。

2 结果

2.1 资生汤活性成分

运用TCMSP 数据库，将筛选条件设为OB ≥50%且DL ≥0.20，共获得8 个活性成分，见表1。

表1 资生汤主要有效成分及来源

2.2 资生汤治疗COPD潜在作用靶点

通过TCMSP 数据库搜集目标中药活性成分对应作用靶点78 个。通过比对Genecards 数据库中COPD 疾病靶点集，最后得到17 个资生汤治疗COPD 的潜在作用靶点。见图1。

图1 资生汤治疗COPD 的潜在作用靶点

2.3 “中药-成分-作用靶点”网络图

将上述筛选得到的中药、有效成分及作用靶点整理得到三者相互对应的数据信息，并导入至Cytoscape 3. 8.2 软件生成“中药- 成分- 作用靶点”网络图，得到1 个90 个节点，97 条边的网络，见图2。

图2 中药-成分-作用靶点网络图

2.4 PPI网络结构

将筛选得到的17 个潜在作用靶点，上传至STRING 数据库，得到PPI 网络数据信息。再利用Cytoscape 3.8. 2 软件构建PPI 网络图，见图3。对网络结构进行拓扑分析，得到各靶点的介度（Betweenness centrality）、紧密度（Closeness centrality）和度（Degree）。以介度、紧密度大于中位数和度大于两倍中位数进行筛选共得到9 个核心靶点，见表2。

图3 资生汤潜在作用靶点PPI 网络

表2 9个核心靶点拓扑学性质

2.5 GO和KEGG分析

利用David 6. 8 数据库进行GO 分析，共得到88 个条目，其中生物过程（biological process，BP）72 个条目，主要涉及细胞凋亡过程和DNA 的转录正调控、一氧化氮生物合成过程正调控等方面；细胞组成（cellular component，CC）8 个条目，主要涉及质膜外侧、溶酶体、胞外区等方面；分子功能（molecular function，MF）8 个条目，主要涉及细胞因子活性等。各取P≤0.01 且排名前8 条目进行可视化作图，见图4。

图4 资生汤治疗COPD 潜在靶点GO 功能分析

KEGG 信号通路富集共获得8 条通路，见图5。通路主要涉及Toll 样受体信号通路（tolllike receptor signaling pathway）、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis）、移植物抗宿主病（graftversus-host disease）等。

图5 资生汤治疗COPD 潜在靶点KEGG 通路分析

2.6 分子结合能力验证

炎症反应是COPD 发生、发展的核心。因此，我们从以上筛选出的9 个核心靶点中选取白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）3 个炎症靶点作为受体与资生汤中8 个有效成分进行分子对接。结果显示8 种有效成分与IL-6、IL-1β、TNF 的Vina affinity 得分均小于-5.0 kcal/mol，提示均有较好的结合能力，见图6。

图6 资生汤有效成分与炎性靶点对接结果（affinity 得分 kcal/mol）

3 讨论

本研究借助网络药理学与分子对接方法来探究资生汤治疗COPD 的物质基础及分子机制。资生汤主要活性成分有恶唑烷-2-酮、紫杉醇、海风藤酮、山酮 C、薯蓣皂苷元、3β-乙酰氧基白术酮、14-去氧-12 （R）-磺酸基穿心莲内酯、玄参苷8 种，涉及IL-6、IL-1β、TNF 等与炎症相关的主要靶点。分子对接结果提示8 种有效成分与以上3 种炎症靶点均具有较好的结合能力。

环境因素与多基因变异的相互作用是COPD发病的关键。目前认为COPD 的发病机制与炎症反应、氧化和抗氧化失衡、气道高反应和主动防御等炎症免疫机制密切相关[8]。然而炎症是COPD发展的中心环节，炎症细胞释放炎性介质和破坏性酶，参与了COPD 肺实质的进行性破坏[9]，并与肺动脉高压发生、发展和预后有着至关重要的联系。IL-6、IL-1β、TNF-α 均能参与COPD 的炎症反应，是介导机体炎症反应的重要细胞因子[10]。IL-6 不仅能激发T 淋巴细胞、B 淋巴细胞分泌炎症介质，促进B 淋巴细胞分化成熟，趋化中性细粒细胞和单核-巨噬细胞，还能增强IL-1β、TNF-α 炎症效应[11]。IL-1β 在气道上皮细胞及肺泡巨噬细胞中发挥作用，又能上调IL-6 表达水平，从而形成IL-6 与IL-1β 互相激发的恶性循环不断放大炎症反应，加重肺部损伤[12]。TNF-α 作为一种重要的促炎细胞因子，在COPD 发展过程中也起着至关重要的作用[13]。研究证实TNF-α 过表达与气流阻塞的程度、肌肉功能障碍密切相关[14]。从KEGG 信号通路分析来看，资生汤可能通过Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）信号通路来发挥治疗作用。目前，已有多项研究表明TLR4 与COPD 的发病密切相关[15]。

综上所述，资生汤可能通过8 种不同活性成分共同作用，抑制TLR 信号通路，下调IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎症因子水平，减轻炎症，阻断肺血管重塑，从而达到治疗COPD 的目的。