长裂藤黄化学成分的分离鉴定及其抗肿瘤活性初筛

张少武，应晶晶，师马俊杰，熊焯，孟祥敏，汪梁，孙雅婷（沈阳医学院药学院，沈阳 110034）

长裂藤黄（Garcinia lancilimba）为藤黄属（Garcinia）植物，主要分布于我国云南、广西等地区[1]。藤黄属植物有着悠久的民间用药历史，具有消炎、止血和杀虫之功效，用于治疗溃疡、湿疮、出血及烫伤等[2]。藤黄属植物的代表性化合物为呫吨酮类、间苯三酚类及萜类化合物等[3-5]，具有抗肿瘤、抗氧化和抗炎等多种药理作用[6-9]。长裂藤黄作为中国特有的藤黄属植物，与其他藤黄属植物相比，其化学成分和活性的相关研究很少，主要的化学成分包括呫吨酮类、联苯类和黄酮类化合物，具有较好的抗肿瘤和抗病毒活性[10-14]。为了丰富藤黄属植物的化合物资源，本文对长裂藤黄叶的化学成分进行研究，采用多种色谱手段进行分离，共得到7个呫吨酮类化合物（见图1），通过理化常数测定、波谱数据分析等方法分别鉴定为1，3，7-trihydroxy-2，4-diprenylxanthone（1）、globuxanthone（2）、2，6-dihydroxy-1，5-dimethoxyxanthone（3）、1，2，5-trihydroxyxanthone（4）、1，2，8-trihydroxyxanthone（5）、1，7-dihydroxyxanthone（6）、1，3，6，7-tetrahydroxy xanthone（7）。

图1 化合物1～7的化学结构Fig 1 Structure of the compounds 1～7

1 材料

Bruker ARX-400核磁共振波谱仪（Bruker 公司，TMS内标）；高效液相色谱仪（日本岛津，SPD-20A紫外检测器，LC-6AB高压输液泵），色谱柱YMC-Pack Pro C18（5 μm，250×20 mm）；OSB-2100旋转蒸发仪（日本EYELA公司）；薄层硅胶板、200～300目硅胶（青岛海洋化工厂），ODS柱色谱填料（15 μm，北京绿百草科技发展有限公司），Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（瑞典GE Healthcare公司）；色谱纯甲醇（天津科密欧公司），氘代试剂DMSO-d6和CDCl3（美国Sigma公司），人原髓细胞性白血病细胞株HL-60（美国ATCC），噻唑蓝（MTT，Biosharp公司），二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司），其他常规试剂均为分析纯；显色剂（10% 硫酸乙醇）。五氟尿嘧啶（5-FU，美国 Sigma公司）。

长裂藤黄叶采自云南省西双版纳热带植物园，经陈渝工程师鉴定为藤黄属植物长裂藤黄Garcinia lancilimba。

2 提取分离

长裂藤黄叶12.4 kg用95%乙醇加热提取3次，每次3 h，合并提取液，回收溶剂，将所得提取物分散于水中，用二氯甲烷等体积萃取并浓缩，得到二氯甲烷萃取物270 g。对二氯甲烷萃取物进行硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇系统（100∶0～0∶100）进行梯度洗脱，得到5个组分Fr.A～Fr.E。对Fr.B组分进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮系统（100∶3～100∶50）进行梯度洗脱，得到8个亚组分Fr.B1～Fr.B8。Fr.B2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱和开放ODS柱色谱（30%～100%甲醇水）纯化得到化合物1（6.5 mg）和化合物2（5.0 mg）。Fr.B4经开放ODS柱色谱（30%～100%甲醇水）和高效液相色谱[70%甲醇水，流速2 mL·min－1，YMCPack C18（5 μm，250 mm×20 mm）]纯化得到化合物6（12.0 mg，tR＝18.0 min）和化合物7（8.0 mg，tR＝13.5 min）。Fr.B6经Sephadex LH-20凝胶柱色谱和开放ODS柱色谱（50%～100%甲醇水）纯化得到化合物3（7.0 mg）、化合物4（10.0 mg）和化合物5（4.0 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：黄色粉末（甲醇），10%硫酸乙醇溶液显黄色，ESI-MSm/z381.2 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：13.08（1H，s，1-OH），7.34（1H，d，J＝8.7 Hz，H-5），7.23（1H，dd，J＝2.3，8.7 Hz，H-6），7.61（1H，d，J＝2.3 Hz，H-8），3.45（2H，d，J＝7.0 Hz，H-1'），5.28（1H，t，J＝7.0 Hz，H-2'），1.88（3H，s，4'-CH3），1.78（3H，s，5'-CH3），3.54（2H，d，J＝7.0 Hz，H-1''），5.26（1H，t，J＝7.0 Hz，H-2''），1.84（3H，s，4''-CH3），1.73（3H，s，5''-CH3）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：158.3（C-1），109.1（C-2），161.0（C-3），105.6（C-4），152.2（C-4a），119.0（C-5），120.5（C-6），153.2（C-7），109.0（C-8），120.7（C-8a），181.0（C-9），103.1（C-9a），152.2（C-10a），21.7（C-1'），121.9（C-2'），133.8（C-3'），26.1（C-4'），18.2（C-5'），22.3（C-1''），121.5（C-2''），135.7（C-3''），26.2（C-4''），18.0（C-5''）。该化合物的波谱数据同文献[15]中的化合物基本一致，故鉴定为1，3，7-trihydroxy-2，4-diprenylxanthone。该化合物为首次从长裂藤黄中分离得到。

化合物2：黄色粉末（甲醇），10%硫酸乙醇溶液显黄色，ESI-MSm/z313.1 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.60（1H，s，1-OH），10.47（1H，s，2-OH），9.22（1H，s，5-OH），7.28（1H，s，H-3），7.30（1H，dd，J＝2.1，8.2 Hz，H-6），7.24（1H，t，J＝8.2 Hz，H-7），7.57（1H，dd，J＝2.1，8.2 Hz，H-8），6.31（1H，dd，J＝10.6，17.4 Hz，H-2'），5.05（1H，d，J＝17.4 Hz，Ha-3'），4.94（1H，d，J＝10.6 Hz，Hb-3'），1.60（6H，s，4'-CH3，5'-CH3）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：146.5（C-1），138.6（C-2），122.8（C-3），125.0（C-4），145.2（C-4a），145.8（C-5），120.1（C-6），123.8（C-7），114.3（C-8），120.1（C-8a），182.7（C-9），109.0（C-9a），145.8（C-10a），39.8（C-1'），146.5（C-2'），111.3（C-3'），26.9（C-4'），26.9（C-5'）。该化合物的波谱数据同文献[16]中的化合物基本一致，故鉴定为globuxanthone。该化合物为首次从长裂藤黄中分离得到。

化合物3：黄色粉末（甲醇），10%硫酸乙醇溶液显黄色，ESI-MSm/z289.1 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.56（1H，s，2-OH），9.40（1H，s，6-OH），7.30（1H，d，J＝8.7 Hz，H-3），7.24（1H，d，J＝8.7 Hz，H-4），6.92（1H，d，J＝8.7 Hz，H-7），7.72（1H，d，J＝8.7 Hz，H-8），3.91（3H，s，1-OCH3），3.78（3H，s，5-OCH3）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：155.7（C-1），147.2（C-2），123.8（C-3），121.6（C-4），150.3（C-4a），134.5（C-5），145.6（C-6），115.6（C-7），114.0（C-8），116.4（C-8a），174.5（C-9），113.8（C-9a），150.0（C-10a），61.4（1-OCH3），61.1（5-OCH3）。该化合物的波谱数据同文献[17]中的化合物基本一致，故鉴定为2，6-dihydroxy-1，5-dimethoxyxanthone。该化合物为首次从长裂藤黄中分离得到。

化合物4：黄色粉末（丙酮），10%硫酸乙醇溶液显黄色，ESI-MSm/z245.1 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.45（1H，s，1-OH），10.45（1H，s，2-OH），9.35（1H，s，5-OH），7.33（1H，d，J＝8.5 Hz，H-3），6.89（1H，d，J＝8.5 Hz，H-4），7.32（1H，brd，J＝8.1 Hz，H-6），7.24（1H，t，J＝8.1 Hz，H-7），7.61（1H，brd，J＝8.1 Hz，H-8）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：148.2（C-1），140.8（C-2），123.5（C-3），108.8（C-4），147.5（C-4a），146.4（C-5），120.3（C-6），124.6（C-7），115.0（C-8），120.0（C-8a），182.1（C-9），106.3（C-9a），145.4（C-10a）。该化合物的波谱数据同文献[17]中的化合物基本一致，故鉴定为1，2，5-trihydroxyxanthone。该化合物为首次从长裂藤黄中分离得到。

化合物5：黄色粉末（甲醇），10%硫酸乙醇溶液显黄色，ESI-MSm/z245.0 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.10（1H，s，1-OH），11.56（1H，s，8-OH），7.37（1H，d，J＝8.6 Hz，H-3），6.69（1H，d，J＝8.6 Hz，H-4），7.02（1H，brd，J＝8.5 Hz，H-5），7.58（1H，t，J＝8.5 Hz，H-6），6.82（1H，brd，J＝8.5 Hz，H-7）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：150.2（C-1），142.8（C-2），125.5（C-3），109.2（C-4），149.5（C-4a），114.4（C-5），134.8（C-6），110.1（C-7），164.4（C-8），113.2（C-8a），179.3（C-9），106.3（C-9a），155.5（C-10a）。该化合物的波谱数据同文献[18]中的化合物基本一致，故鉴定为1，2，8-trihydroxyxanthone。该化合物为首次从长裂藤黄中分离得到。

化合物6：黄色粉末（甲醇），10% 硫酸乙醇溶液显黄色，ESI-MSm/z229.1 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.65（1H，s，1-OH），10.10（1H，s，7-OH），6.78（1H，dd，J＝0.8，8.5 Hz，H-2），7.70（1H，t，J＝8.5 Hz，H-3），7.05（1H，dd，J＝0.8，8.5 Hz，H-4），7.55（1H，d，J＝9.0 Hz，H-5），7.36（1H，dd，J＝3.0，9.0 Hz，H-6），7.44（1H，d，J＝3.0 Hz，H-8）。该化合物的波谱数据同文献[19]中的化合物基本一致，故鉴定为1，7-dihydroxyxanthone。

化合物7：黄色粉末（甲醇），10% 硫酸乙醇溶液显黄色，ESI-MSm/z261.0 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：13.18（1H，s，1-OH），6.14（1H，d，J＝2.2 Hz，H-2），6.30（1H，d，J＝2.2 Hz，H-4），6.77（1H，s，H-5），7.35（1H，s，H-8）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：162.6（C-1），98.0（C-2），164.5（C-3），93.5（C-4），157.3（C-4a），102.2（C-5），151.1（C-6），143.7（C-7），108.0（C-8），111.5（C-8a），178.9（C-9），101.6（C-9a），154.2（C-10a）。该化合物的波谱数据同文献[20]中的化合物基本一致，故鉴定为1，3，6，7-tetrahydroxyxanthone。

4 抗肿瘤活性检测

采用MTT方法检测分离得到的呫吨酮类化合物对人原髓细胞性白血病细胞株HL-60的抑制活性。取对数生长期的HL-60细胞接种于96孔培养板内，次日加入不同浓度分离得到的化合物稀释液，同时设立空白对照，继续培养24 h。然后每孔加入50 μL 5 mg·mL－1的MTT溶液于37℃孵育4 h后，弃去上清液，每孔加入200 μL DMSO溶解结晶，室温振荡10 min后，在酶标仪570 nm处测量每个孔的光密度值（OD），并计算得到半数抑制浓度（IC50）。结果显示从长裂藤黄中分离得到的7个呫吨酮类化合物具有很好的细胞生长抑制作用，其IC50值分别为7.1、3.8、16.2、13.7、23.5、22.0、18.4 μmol·L－1，阳性对照药5-氟尿嘧啶的IC50为3.4 μmol·L－1。

5 讨论

藤黄属药用植物最具代表性的化合物为呫吨酮类化合物，本文从长裂藤黄中分离得到了7个呫吨酮类化合物，其中化合物1～5为首次从该植物中分离得到，化合物6和7在已发表的大苞藤黄和长裂藤黄相关文献中报道过。分离得到的7个化合物具有很好的HL-60细胞抑制活性，与简单氧代呫吨酮相比，结构中含有异戊烯基的化合物表现出了更强的细胞生长抑制作用。该研究进一步丰富了长裂藤黄的次级代谢产物的多样性，为其资源合理的开发应用提供科学依据。从近几年分离得到的化合物的结构以及活性数据来看，长裂藤黄仍有一定的研究发展空间，有待于进一步深入研究。