半夏水溶性成分抗氧化活性谱效关系研究

张雪丽，杨长福，李玮，杨菁，刘杰英，杨涛，林昶，2*（. 贵州中医药大学，贵阳 550025；2. 贵州中医药大学 林下中药材研究中心，贵阳 550025）

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎[1]，主要化学成分为生物碱类、有机酸类、多糖、黄酮类、挥发油、半夏蛋白、氨基酸以及微量元素等[2-3]，具有镇咳祛痰、镇吐、抗早孕、抗溃疡、抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化等药理作用[4-5]。此外，半夏还具有抗氧化活性，研究发现其与心血管疾病、动脉粥样硬化[6]、肿瘤及炎症[7]等的发生密切相关。在半夏抗氧化能力研究中，有学者发现以 DPPH 和羟基自由基（·OH）为抗氧化指标，半夏多糖均有清除效果，且对DPPH的清除能力大于·OH[8]；半夏生物碱同样具有抗氧化能力[9]，分别以DPPH自由基、超氧阴离子自由基（O2－·）、·OH进行研究，其清除率呈减小趋势，对DPPH自由基的清除能力最大。此外半夏中β-谷甾醇、半夏水提液[10]、醇提液[11]同样具有抗氧化能力，但半夏水提液及醇提液中抗氧化活性成分的物质基础及半夏中其他成分是否具有抗氧化活性，目前尚未见相关研究报道。本文通过灰色关联度及偏最小二乘回归分析研究半夏HPLC指纹图谱与抗氧化活性的谱效关系，初步筛选出与抗氧化活性相关的色谱峰，可为进一步揭示半夏水提液抗氧化活性成分提供参考。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate3000高效液相色谱仪、1530型酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]，LCLX-L408型台式低速离心机（上海力辰邦西仪器科技有限公司），AUW220D型分析天平（苏州岛津仪器有限公司），SHZ-Ⅲ循环水式真空泵（上海亚荣生化仪器厂），YQ-1000A超声波清洗仪（上海易净超声波仪器有限公司），WP-UP-WF-20微量分析型超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）。

1.2 试药

对照品鸟苷（纯度：93.6%，批号：111977-201501）、腺苷（纯度：99.7%，批号：110879-201703）、尿苷（纯度：99.5%，批号：110887-201803）、腺嘌呤（纯度：99.4%，批号：110886-201102）、尿嘧啶（纯度：99.6%，批号：100469-201302）（中国食品药品检定研究院）；对照品β-胸苷（纯度：98.0%，批号：C100897-211107，贵州迪大科技有限责任公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris，批号：C13383711）、硝基四氮唑蓝（NBT，批号：C13692681）（上海麦克林生化科技有限公司）；吩嗪硫酸甲酯（PMS，批号：H2131077）、还原性辅酶Ⅰ二钠盐（β-NADH，批号：L2115726）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ，批号：T819085）、2，2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS，批号A109612）（美国阿拉丁工业公司）；乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

市售的不同批次半夏药材均由贵州中医药大学魏升华教授鉴定为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎，详见表1。

表1 半夏样品产地信息Tab 1 Origin information for Pinelliae Rhizoma sample

2 方法与结果

2.1 半夏HPLC指纹图谱研究

2.1.1 供试品溶液的制备 取半夏粉末（过四号筛）2.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入20 mL蒸馏水，称重，超声60 min（500 W，50 Hz），冷却后，补重，4000 r·min－1离心5 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，即可。

2.1.2 对照品溶液的制备 取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、β-胸苷、腺苷对照品适量，精密称定，以蒸馏水溶解后定容至10 mL，再分别取1 mL以蒸馏水定容至10 mL，配制成含有19.4 μg·mL－1尿嘧啶、12.2 μg·mL－1尿苷、11.1 μg·mL－1腺嘌呤、12.1 μg·mL－1鸟苷、10.7 μg·mL－1β-胸苷、11.6 μg·mL－1腺苷的混合对照品溶液，过0.45 μm的微孔滤膜，备用。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：Welch Ultimate AQC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～10 min，1%A，10～25 min，1%～2%A，25～45 min，2%～15%A，45～50 min，15%～20%A，50～60 min，20%～10%A）；柱温30℃；检测波长260 nm；流速0.8 mL·min－1；进样量10 μL。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验 取供试品溶液，连续进样6次，将5号尿苷色谱峰定为参照峰（S）。计算得到各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD值均＜3%，表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验 取同一批次半夏粉末（S12）2.0 g，精密称定，按“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样分析，计算得到各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均＜3%，表明该法重复性良好。

2.2.3 稳定性试验 取半夏供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，计算得到各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均＜3%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3 HPLC指纹图谱的建立

分别取30批次的半夏粉末2.0 g，精密称定，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012版）[12]，以S5样品色谱图为参照指纹图谱，确定了15个共有峰，建立半夏HPLC共有模式生成对照图谱，结果见图1、2。30批半夏指纹图谱相似度在0.749～0.989，其中除S24、S25两个产地外，其他产地相似度均大于0.850，相似度结果见表2。通过混合对照品溶液HPLC色谱峰对比，指认了其中6个成分，分别是3号峰尿嘧啶、5号峰尿苷、6号峰腺嘌呤、7号峰鸟苷、9号峰β-胸苷、11号峰腺苷，见图3。

图1 半夏的对照指纹图谱（R）及指纹图谱Fig 1 Control fingerprint（R）and fingerprint of Pinelliae Rhizoma

图2 半夏HPLC对照指纹图谱Fig 2 Control fingerprint of Pinelliae Rhizoma

图3 混合对照品HPLC色谱图Fig 3 HPLC chromatogram of mixed reference substance

表2 30批半夏指纹图谱相似度分析结果Tab 2 Fingerprint similarity of 30 batches of Pinelliae Rhizoma

2.4 体外抗氧化活性测定

2.4.1 ABTS自由基清除率 参考文献方法[13]，并稍作修改，制备ABTS储备液，临用时以蒸馏水稀释，即得ABTS工作液。另取“2.1.1”项下供试品溶液31.3、62.5、125、250、500、1000 μL于2 mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，即得不同浓度半夏水提液，分别设置空白组（蒸馏水20 μL＋ABTS工作液180 μL，测定吸光度记为A0），样品组（半夏水提液20 μL＋ABTS工作液180 μL，测定吸光度记为A1），对照组（半夏水提液20 μL＋蒸馏水180 μL，置于96孔板中混匀，避光室温下静置5 min，酶标仪中振荡1 min，测定吸光度记为A2），重复3次，每次3个复孔。按公式（1）计算不同浓度样品液清除率，导入SPSS 26.0计算不同产地样品IC50值（以生药浓度计算），结果见表3。

表3 30批半夏体外抗氧化活性测定结果Tab 3 In vitro antioxidant activity of 30 batches of Pinelliae Rhizoma

2.4.2 O2－·清除率 参考文献方法[14-15]，以16 mmol·L－1的Tris-HCl缓冲液分别配制150 μmol·L－1NBT、234 μmol·L－1NADH和30 μmol·L－1PMS溶液，置于4℃冰箱保存备用。另取“2.4.1”项下稀释的不同浓度的半夏水提液，分别设置空白组（蒸馏水10 μL＋100 μL NBT溶液＋100 μL NADH溶液＋100 μL PMS溶液，测定吸光度记为A0），样品组（半夏水提液代替空白组中蒸馏水，测定吸光度记为A1），对照组（半夏水提液10 μL＋300 μL Tris-HCl缓冲液，于96孔板中混匀，室温下反应5 min，测定吸光度记为A2），重复3次，每次3个复孔。按公式（1）计算清除率，导入SPSS 26.0计算不同产地样品IC50值（以生药浓度计算），结果见表3。

2.4.3 总抗氧化能力（FRAP）法 参考文献方法[16]，制备FRAP工作液。分别设置空白组（蒸馏水20 μL＋FRAP工作液180 μL，测定吸光度记为A0），样品组[半夏水提液代替空白组中蒸馏水，于96孔板中混匀，酶标仪（37℃）下静置10 min，测定吸光度记为A1]。另参考文献方法[17]，配制浓度分别为0.10、0.20、0.40、0.60、0.80以及1.00 mmol·L－1的FeSO4溶液，同上测定A值，以FeSO4浓度为横坐标，（A1－A0）为纵坐标绘制标准曲线。分别计算半夏水提液总抗氧化能力（FeSO4值）。重复3次，每次3个复孔，结果见表3。

2.5 谱效关系研究

2.5.1 灰色关联度分析 由灰色系统理论，分别以“2.4”项下3种方法测得半夏抗氧化活性为参考序列，30批供试品半夏药材的共有峰峰面积为比较序列，参考文献方法[16]对数据进行处理，结果见表4，ABTS法测定的抗氧化活性与各峰关联度排名为色谱峰1＞5＞11＞14＞10＞12＞7＞2＞4＞9＞6＞15＞3＞8＞13，关联度均大于0.75；FRAP法测定的抗氧化活性与各峰关联度排名为色谱峰6＞7＞9＞15＞14＞4＞5＞1＞13＞12＞8＞10＞2＞11＞3，关联度均大于0.80；O2－·法测定的抗氧化活性与各峰关联度排名为色谱峰5＞6＞7＞14＞1＞12＞9＞3＞8＞11＞4＞15＞2＞10＞13，关联度均大于0.75，峰5、6、7、14在两个抗氧化指标中关联度居于前五位，其与抗氧化活性关联性最强。

表4 抗氧化活性与各峰之间关联度Tab 4 Correlation between antioxidant activity and chromatographic peaks

2.5.2 偏最小二乘回归分析 参考文献方法[17-18]，利用 SIMCA 14.1 软件，以30批半夏水提物的ABTS、O2－·清除率的IC50、FeSO4值为因变量x，共有峰峰面积为自变量y，运用偏最小二乘回归分析，计算标准化回归系数和VIP值，评价半夏水提物与抗氧化活性之间的关联。结果以ABTS为指标，与之成正相关的峰，贡献程度由大到小为峰14、5、4、12；与之成负相关的峰，贡献程度由大到小为峰6、8、3、10、11、15、2、7、1、13、9。以FRAP为指标，与之成正相关的峰，贡献程度由大到小为峰1、13、8、2、6、14、12、10、4；与之成负相关的峰，贡献程度由大到小为峰5、11、9、3、15、7。以·为指标，与之成正相关的峰，贡献程度由大到小为峰10、3、7、2、14、5、9；与之成负相关的峰，贡献程度由大到小为峰4、1、13、12、15、11、6、8（见图4）。VIP值被称为变量投影重要性指标[19]，在统计分析中用其表示x对y的解释能力，当VIP值（＞1）越大，其相对解释能力则越强，以ABTS为指标，VIP＞1的峰由大到小为峰5、14、6、7、8；以FRAP为指标，VIP＞1的峰由大到小为峰5、11、6、13、15；以O2－·为指标，VIP＞1的峰由大到小为峰11、7、1、4、10、2、13，以上3个指标中VIP＞1的峰5、6、7、11均出现两次（不同指标中排名前五），峰14虽然只出现一次，但其偏回归系数在ABTS中正相关程度最高，且结合灰色关联度法的分析结果，得到与半夏抗氧化活性相关联性最密切的几个峰为5（尿苷）、6（腺嘌呤）、7（鸟苷）、11（腺苷）、14号峰（见图5）。

图4 半夏提取物各共有峰与抗氧化指标间偏回归系数Fig 4 Partial regression coefficient between common peaks of Pinelliae Rhizoma extract and antioxidant indexes

图5 半夏提取物各共有峰与抗氧化指标间VIP值Fig 5 VIP value between common peaks of Pinelliae Rhizoma extract and antioxidant indexes

3 讨论

本研究前期建立指纹图谱时，考察了不同的流动相（乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-水、甲醇-水）对样品的洗脱效果，结果乙腈-水为流动相时，基线较平稳，分离效果较好；对210、260、310 nm 3个波长进行考察，在260 nm波长下，色谱图的整体效果较好，大多数成分均有吸收，色谱峰较多，因此选择了检测波长为260 nm；考察流速分别为0.6、0.8、1.0 mL·min－1时色谱峰分离度，结果流速在0.8 mL·min－1时色谱峰的峰形及分离效果均较好，故选择了流速为0.8 mL·min－1。此外对提取条件进行了考察，分别考察了不同提取方法（超声及回流法），不同提取溶剂（蒸馏水、5%甲醇、10%甲醇），不同提取时间（30、60、90 min）及不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15），结果以文中提取条件最佳。

体外抗氧化的研究方法较多，诸如化学分析法及细胞抗氧化活性法等[20]，在化学分析法中又分为基于还原能力测定的铁离子还原能力（FRAP），铜离子还原能力及普鲁士蓝法，基于自由基清除能力测定的ABTS法[12]、DPPH法[13]、·OH法及O2－·等[20]方法，其中FRAP法在天然植物的抗氧化能力研究中应用较多，但局限于测定结果仅能表明抗氧化剂的还原能力，在体外抗氧化研究中往往与自由基清除能力的测定方法结合应用，更好地说明测定成分的抗氧化能力，本研究发现半夏水提物中含有多糖类成分，以DPPH法进行测定，会产生白色絮状沉淀，干扰实验结果，因此选择ABTS法结合O2－·及FRAP法为指标进行体外抗氧化研究。中药指纹图谱因其影响因素多、图谱复杂等特点，分析时通常需要阐明其不同成分之间的互作关系，灰色关联度法在一定程度上能较为客观地体现各变量间的相互影响[21]；而偏最小二乘回归分析在多元统计分析的基础上还能建立两变量间的回归模型，从而进行变量关系的预测分析[22]，本文综合灰色关联度法与偏最小二乘回归分析，分析得到半夏HPLC指纹图谱中与抗氧化活性关联性最强的几个峰为5（尿苷）、6（腺嘌呤）、7（鸟苷）、11（腺苷）、14号峰。体外抗氧化的研究报道中尿苷[23]、鸟苷、腺苷[24]均具有抗氧化作用，王惠等[25]在蝉花抑菌抗氧化谱效关系的研究中筛选出与抗氧化密切相关的成分中同样含有鸟苷、腺苷。李兵[26]的研究提示一定剂量的蛹虫草腺苷可通过调节小鼠肾脏抗氧化酶的活力，从而减轻肾脏氧化应激所造成的损伤。文中并未指认出14号峰，后续可通过液质联用等手段继续研究。

研究报道半夏可以降低动脉粥样硬化内膜增生大鼠的血脂水平[27]，具有抗动脉粥样硬化作用，但其作用机制尚未完全清楚。有学者以氧化应激为切入点，研究发现血管内氧自由基及其产物的增加与动脉粥样硬化密切相关，其中被氧化的低密度脂蛋白会干扰血管合成释放一氧化氮（NO），使正常的血管舒缩功能受到影响，还能参与调控相关因子的表达，从而影响血管内皮功能及机体凝血功能，促进动脉粥样硬化[28]，而抗氧化剂可以防止低密度脂蛋白氧化[29]，减轻机体氧化应激。本研究中尿苷、鸟苷、腺苷等核苷类成分可在体外发挥抗氧化作用，体内研究表明腺苷A2B受体在机体内也可以参与调节血管氧自由基[30]，但该核苷类成分是否为半夏机体内抗氧化的物质基础，能否减轻机体氧化损伤还有待进一步研究。

综上，本文对半夏HPLC指纹图谱与抗氧化活性的谱效关系进行初步研究，其水溶性成分抗氧化活性为多成分协同发挥作用，为半夏体外抗氧化活性物质基础研究提供参考。