建昌帮炆法对远志4种成分在大鼠体内药代动力学和组织分布的影响研究

熊晓莉，陆美霞，施林峰，钟凌云，叶喜德（江西中医药大学药学院，南昌 330004）

远志为远志科植物远志Polygala tenuifoliaWilld.或卵叶远志Polygala sibiricaL.的干燥根[1]，具有安神益智之功，临床上多用于心肾不交之心神不宁、失眠健忘等证[2]。远志生品对机体刺激性大，服后易“戟人咽喉”。远志经炮制后可减少其刺激性，缓解药性，达到减毒增效之目的[3]，2020年版《中国药典》收载的远志炮制品为甘草制品，是目前常用炮制品，而炆远志为江西“建昌帮”特色炮制品，该法系指将远志低温长时间加热，并加入辅料甘草汁，在微火慢蒸过程中，借助辅料与药物成分之间的相互作用，使药物化学成分发生变化，从而影响药效。临床经验证明，远志经炆制后可增强药物疗效，并使其保留“原汁原味、醇香浓郁、厚而不腻”等特征[4]。现代研究表明，远志主含皂苷类、寡糖酯类、酮类等成分，其中寡糖酯类成分是其主要有效活性成分之一[5-6]。课题组前期研究了远志炆制前后成分的变化，发现炆制后远志中寡糖酯类成分含量均有所下降[7]。在对比分析远志生品与炆制品差异时发现，远志中所含西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、3，6'-二芥子酰基蔗糖、黄花远志素A、细叶远志苷A等成分是其主要差异性成分[8]。但前期并未对这些主要差异性成分开展体内过程研究，致使远志经炆制后药效增强这一理论，仍缺乏科学数据支撑。基于此，本研究以“建昌帮”炆远志为对象，从药代动力学和组织分布角度，运用UPLC-MS/MS分析技术，研究远志炮制前后西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、细叶远志苷A、3，6'-二芥子酰基蔗糖等4种寡糖酯类成分在大鼠血浆和组织中的浓度分布情况，拟通过对比分析炆制前后血浆和组织中各成分浓度差异，为远志炆制后药效增强理论提供数据支撑。

1 材料

1.1 仪器

岛津 LC-30A 型超高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；QQQ4500型串联三重四极杆质谱仪（美国 AB Sciex 公司），FA1004N万分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；AE240十万分之一电子天平（美国 Mettler-Toledo 公司）；YF-111B高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；OSB-2200XU旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；XW-80AXUA旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；Neofuge 13R 型高速冷冻离心机（上海力申科学仪器公司）；ANPEL DC12氮吹仪（上海安谱科学仪器有限公司）。

1.2 试药

远志药材购于山西汉广中药材加工有限公司，产地为山西运城；甘草购于安徽汇仁堂中药饮片有限公司，经江西中医药大学中药鉴定室刘应蛟副教授鉴定，分别为远志科植物远志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根和豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根及根茎。西伯利亚远志糖A5对照品（批号：MUST-21052704，纯度：93.91%）、西伯利亚远志糖A6对照品（批号：MUST-20082523，纯度：96.42%）（成都曼思特生物科技有限公司）；细叶远志苷A对照品（批号：wkq20073005）、3，6'-二芥子酰基蔗糖对照品（批号：wkq21031112）、芦丁对照品（批号：wkq20030203）（四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均≥98%）。水为屈臣氏纯净水，乙腈、甲醇、甲酸为质谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

SPF 级雄性 SD大鼠，体质量为 220～250 g[济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号为SCXK（鲁）20190003]。大鼠在标准环境下[温度（23±1）℃，湿度（55±5）%]适应性喂养 7 d，给药前禁食12 h，自由饮水。本研究涉及的动物实验经江西中医药大学研究伦理委员会审查批准（批准号：JZLLSC20220493）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱（0～3 min，10%～95%B；3～4 min，95%B；4～4.1 min，95%～10%B；4.1～6 min，10%B）；流速 0.2 mL·min－1；进样体积 1 μL；柱温 40℃。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），采用负离子模式检测，扫描模式为多反应监测（MRM），喷雾电压（IS）4500 V，离子源温度（TEM）450℃，离子源气压1（GS1）45 kPa，离子源气压2（GS2）50 kPa，气帘气（CUR）10 psi，碰撞气（CAD）9 psi。其他特征参数见表1。

表1 各指标成分及内标的质谱参数Tab 1 Mass spectrum parameters of each index component and internal standard

2.3 受试药物的制备

2.3.1 炮制品的制备 生远志按《中国药典》2020年版一部炮制方法制备。炆远志按《江西省中药饮片炮制规范》（2008年版）[9]炮制方法制备：取净甘草，切段，与净远志搅匀，置炆药坛内，加适量40℃温水（以平药面为度）；坛四周堆适量谷糠，点火，液面保持沸腾炆制5 h，起坛，捡去甘草，干燥。每100 kg 远志，用甘草6 kg。

2.3.2 远志乙醇提取物的制备 取生远志、炆远志各50 g，粉碎后过三号筛，先后加10倍量、8倍量60% 的乙醇回流提取2次，每次提取1 h，滤过，合并滤液，滤液水浴减压旋转蒸发，得无醇味浸膏，于－4℃保存。使用前加水至100 mL，至生药含量为0.5 g·mL－1。

2.4 给药和样品的采集

2.4.1 血浆样品 将健康雄性 SD 大鼠 12 只，随机分成两组（生品组 S1～S6，炆制组W1～W6），每组 6只。给药前 12 h 禁食不禁水，按剂量 10 mL·kg－1灌胃给予生远志、炆远志提取物，于给药前及给药后 5、10、20、30、45 min和1、1.5、2、3、5、8、12 h 自眼底静脉丛取血，每次 0.3 mL，置于1.5 mL 肝素钠 EP 管中，3500 r·min－1离心15 min，分离上层血浆，于－80℃冷冻保存。

2.4.2 组织样品 将健康雄性 SD 大鼠 48只，随机分成两组（生品组 S1～S24，炆制组W1～W24），每组 24只，给药前 12 h 禁食不禁水。按剂量 10 mL·kg－1灌胃给予生远志、炆远志提取物，于给药前及给药后 0.5、2、5 h（每个时间点各 6只）4个时间点断颈处死大鼠，立即解剖采集心、肝、肺、肾、小肠、脑等组织。用冰生理盐水洗净，滤纸沾干，置于EP管中，于－80℃冷冻保存。

2.5 样品的处理

2.5.1 血浆样品 取100 μL大鼠血浆样品，置于1.5 mL 离心管中，加芦丁内标溶液 10 μL，旋涡混合3 min，再加入600 μL甲醇，涡旋震摇3 min，13 200 r·min－1离心 10 min，取上清液置于EP管中，35℃氮气吹干，残渣加100 μL甲醇复溶，漩涡震荡3 min，3500 r·min－1离心5 min，取上清液1 μL进样。

2.5.2 组织样品 取出大鼠组织样品，解冻后将各组织剪碎，混合均匀。精密称取各组织置于EP管中，按组织-生理盐水1∶3的比例加冰生理盐水，用匀浆机制成匀浆。取上层组织匀浆100 μL，按“2.5.1”项下血浆样品同法处理。

2.6 对照品溶液的制备

2.6.1 混合对照品溶液的制备 精密称取西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、细叶远志苷A、3，6'-二芥子酰基蔗糖对照品适量，加甲醇制成西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、细叶远志苷A均为9.0 μg·mL－1，3，6'-二芥子酰基蔗糖为2.88 μg·mL－1的混合对照品溶液，并逐级稀释，制得系列溶液。以低（49.9、50.0、49.9、16.0 μg·L－1）、中（999.2、999.6、999.2、320.0 μg·L－1）、高（8992.8、8996.4、8992.8、2880 μg·L－1）质量浓度的对照品溶液，用于药代动力学研究。加甲醇制成西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6均为1.0 μg·mL－1，细叶远志苷A为2 μg·mL－1，3，6'-二芥子酰基蔗糖为0.6 μg·mL－1的混合对照品溶液，并逐级稀释，制得系列溶液，以低（10.1、10.0、20.0、5.9 μg·L－1）、中（50.4、49.9、100.0、29.6 μg·L－1）、高（504.0、498.8、1000.1、296.2 μg·L－1）质量浓度的对照品溶液，用于组织分布研究。

2.6.2 内标溶液的制备 精密称取芦丁适量，加甲醇制成质量浓度为6.4 μg·mL－1的芦丁内标溶液。

2.7 方法学考察

2.7.1 专属性考察 取大鼠空白血浆和肝组织匀浆（作为组织样品分析的代表）、加对照品和内标溶液的空白大鼠血浆和肝组织匀浆、给药30 min后的大鼠血浆和肝组织匀浆，按“2.5”项下方法处理，分析得空白血浆和肝组织匀浆、血浆和肝组织样品图谱，见图1。

图1 各指标成分及提取离子流 UPLC-MS/MS 图Fig 1 Components and extraction ion current UPLC-MS/MS

2.7.2 线性范围及定量限 取100 μL空白大鼠血浆和心、肝、肺、肾、脑、肠组织匀浆，分别加入“2.6.1”项下混合对照品系列溶液，按“2.5”项下方法处理，配制成系列浓度的血浆和组织样品，以指标成分的血药浓度为横坐标（X，μg·L－1），以指标成分与内标物的峰面积比为纵坐标（Y），用加权（1/χ2）最小二乘法进行线性回归，得到相应的线性回归方程。结果表明，各待测成分在相应范围内线性关系较好，符合生物样品分析要求，结果见表2。

表2 各指标成分在大鼠血浆和组织中的标准曲线和线性范围Tab 2 Standard curves and linear ranges for each indicator component in the rat plasma and tissues

2.7.3 精密度和准确度 取100 μL空白大鼠血浆和肝组织匀浆，分别加入“2.6.1”项下低、中、高3个质量浓度的混合对照品溶液，每个浓度取6份，按“2.5”项下方法处理，配制药代动力学和组织分布质控（QC）样品，连续测定3 d。以各分析批内随行标准曲线计算日内和日间精密度（RSD）及准确度（RE）。各指标成分在血浆中日内RSD≤8%，日间RSD≤9%，RE为－9.57%～9.64%；在肝组织中日内RSD≤11%，日间RSD≤13%，RE为－10.34%～11.28%。结果均＜15%，表明该法精密度和准确度良好，符合生物样品分析要求。

2.7.4 残留效应考察 取100 μL空白大鼠血浆和肝组织匀浆，分别加入“2.6.1”项下高质量浓度的混合对照品溶液，每个浓度取6份，按“2.5”项下方法处理，配制药代动力学和组织分布QC样品，进样分析；取空白大鼠血浆和肝组织样品，不加内标溶液，同法操作。各指标成分和内标溶液的残留峰面积分别小于定量下限质量浓度QC血浆和肝组织对应成分峰面积的15%、5%，表明该法各指标残留效应符合生物样品分析要求。

2.7.5 提取回收率和基质效应 取100 μL空白大鼠血浆和肝组织匀浆，分别加入“2.6.1”项下低、中、高3个质量浓度的混合对照品溶液，每个浓度取6份，按“2.5”项下方法处理，得不同浓度的药代动力学和组织分布QC样品，进样测得各色谱峰面积A；取空白血浆和肝组织匀浆，按“2.5”项下方法沉淀蛋白后，取上清液分别加入低、中、高质量浓度的混合对照品溶液，氮气吹干溶剂，复溶后同法测定，得各色谱峰面积B；取“2.6.1”项下低、中、高3个质量浓度的混合对照品溶液加入内标溶液，同法操作，得各色谱峰面积C；提取回收率＝A/B×100%，基质效应＝B/C×100%。各指标成分在血浆中提取回收率为84.64%～97.69%，RSD＜6%，基质效应为84.77%～104.51%，RSD＜5%；各指标成分在肝组织中提取回收率为86.21%～103.36%，RSD＜7%，基质效应为83.52%～107.48%，RSD＜6%，符合生物样品分析要求。

2.7.6 稳定性实验 取100 μL空白大鼠血浆和肝组织匀浆，分别加入“2.6.1”项下低、中、高3个质量浓度的混合对照品溶液，每个浓度取6份，并置于以下4种条件下考察远志中4种指标成分在大鼠血浆和肝组织中的稳定性：血浆和肝组织匀浆样品室温放置4 h后，按“2.5”项下方法处理再测定；血浆和肝组织匀浆样品按“2.5”项下方法处理后，在室温放置24 h后再测定；血浆和肝组织匀浆样品－80℃放置3周及－80℃ 冻融循环3次后，按“2.5”项下方法处理再测定。结果表明，各指标成分在4种考察条件下的RSD均在±15% 以内，符合生物样品分析要求。

2.8 药代动力学研究

大鼠灌胃生远志提取物、炆远志提取物后，采用“2.4”项下方法隔点取血，再按“2.5.1”项下方法处理。以血药浓度为纵坐标，时间为横坐标采用 GraphPad Prism 7软件绘制浓度-时间曲线，见图2。采用DAS 3.2.1软件计算药代动力学参数。运用SPSS 21.0软件进行统计分析，见表3。结果表明，与生远志组相比，炆远志组中西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、3，6'-二芥子酰基蔗糖的药代学动力参数Cmax、AUC0～12均显著增加（P＜0.05），细叶远志苷A的Cmax、AUC0～12有增加趋势。炆远志中4种寡糖酯类成分的Vz/F和CLz/F较生远志明显降低（P＜0.05）。

图2 生远志、炆远志中4种成分的浓度-时间曲线（n＝6，x ±s）Fig 2 Time curves of 4 constituents in Polygala tenuifolia and Licoricesimmered Polygala tenuifolia（n＝6，x±s）

表3 4种成分的药代动力学参数(n＝6，x±s)Tab 3 Pharmacokinetic parameters of 4 components (n＝6，x±s)

2.9 组织分布研究

大鼠灌胃生远志提取物、炆远志提取物后，采用“2.4”项下方法在4个时间点取组织，再按“2.5.2”项下方法处理，样品进样分析。给药前，4种寡糖酯类成分在大鼠各组织中均未检测到，同一个化合物在不同器官的4个时间点浓度分布见表4。结果表明，与生远志组相比，炆远志组中西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、细叶远志苷A、3，6'-二芥子酰基蔗糖的组织分布浓度整体均增大。

表4 4种成分在不同组织中的浓度(x±s，n＝6，μg·L－1)Tab 4 Tissue distribution concentration of 4 components (x ±s，n＝6，μg·L－1)

3 讨论

前期预实验采用正负离子两种模式进行成分检测，发现西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、细叶远志苷A、3，6'-二芥子酰基蔗糖在负离子模式下灵敏度更高，响应强度更大，这与文献报道相吻合[10]，且负离子模式检测时间短、经济，因此，选择负离子模式进行定量分析。《中国药典》2020年版一部规定远志对人最大给药量换算成大鼠为0.9 g·kg－1，结合文献[11]，按远志生药量5 g·kg－1大鼠体质量灌胃给药。

本文首次采用UPLC-MS/MS 测定炆远志与生远志中西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、细叶远志苷A、3，6'-二芥子酰基蔗糖4种寡糖酯类成分在大鼠血液中的药代动力学参数。前期研究表明，与生远志相比，炆远志中大多数成分含量下降[7]。

根据血浆药代动力学的结果，选取了给药前及给药后0.5、2、5 h进行组织分布研究，分别代表吸收相、分布相，4种成分在各组织中的浓度由高到低为2 h＞0.5 h＞5 h，再根据4种成分的tmax均为2 h左右，推测这些成分在组织分布中的tmax为2.5～3 h。与生远志组相比，炆远志组中4种成分在6个组织中的浓度整体呈增加趋势。西伯利亚远志糖A5和细叶远志苷A在心、肝、肺、肾、脑和小肠6个组织中都有分布，表明这两个成分在组织中分布广泛；西伯利亚远志糖A6在肝、肺、肾、小肠4个组织中有分布，3，6'-二芥子酰基蔗糖在肝、肾、小肠中有分布，这两个成分在心、脑中都没有检测到，且在组织中浓度都不高，可能跟这两个成分入血浓度不高，再经过肝肠循环，大部分被代谢了有关。4种成分整体在小肠中浓度最高，这可能与灌胃给药后，药物经过小肠吸收进入体内有关[12]，其次在肾、肝、肺中浓度也较高，这与远志入肾、肺经吻合，在脑和心中浓度低，表明这4种成分的原形不易透过血脑屏障。有文献报道，远志中寡糖酯类成分不稳定，酯键易水解转化为次级苷和苷元[13-14]，因此，可能是这4种寡糖酯的代谢产物在脑部发挥药效，但在心中浓度低与远志入心经不符，后期需进一步研究。

综上所述，与生品相比，远志炆制后可促进西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、细叶远志苷A和3，6'-二芥子酰基蔗糖4种寡糖酯类成分在大鼠体内的吸收和分布，使其血药浓度增加，组织分布浓度增加，提高其生物利用度。此外，文献研究表明远志炆制后可提高学习记忆能力，增强安神益智作用[15]，其中寡糖酯类成分是远志发挥安神益智药效的主要成分之一[16-18]。因此，推测远志炆制后药效增强可能与西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、3，6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A 4种有效成分的吸收和分布增强有关。本研究可为深入研究“建昌帮”特色饮片炆远志炮制机制提供数据支撑，但远志炆制后有效成分在体内吸收与分布作用增强的原因还需深入研究。