榆中县黄瓜根结线虫鉴定及根系定殖效果测定

马耀杰 程开勇 徐秉良 张树武

摘 要 為了明确甘肃榆中县温室大棚黄瓜根结线虫种类及根际定殖情况，采用形态和分子生物学鉴定其种类，并室内测定和显微观察其在根际定殖效果。结果表明，甘肃榆中县黄瓜根结线虫不同虫态形态、大小和雌虫会阴花纹特征等均具有典型南方根结线虫（Meloidogyne incognita）形态特征。基于线粒体COI基因序列比对和构建系统发育树，鉴定发现榆中县黄瓜根结线虫线粒体COI基因序列与已报道的南方根结线虫台湾株系（KU517167）聚为一类，其相似性为99.75%；根结线虫多序列特异位点鉴定发现其与南方根结线虫孟加拉国株系（MN196556）和南方根结线虫印度株系（MN728697）聚为一类，相似性分别为100%和96.91%。经致病性测定发现，待接种根结线虫2龄幼虫30 d后其能够侵染黄瓜根系并形成大量根结，经染色发现黄瓜幼苗根系组织内寄生大量线形蠕虫、雌虫和卵囊，且镜检观察发现其形态与田间采集后分离的线虫形态一致。综上可知，引起甘肃省榆中县黄瓜根结线虫病的病原为南方根结线虫。

关键词 甘肃榆中；根结线虫；鉴定；定殖

根结线虫（Root-knot nematodes）是一类种类多、寄主范围广和危害重的植物寄生线虫，据统计其种类多达90多种，可侵染3  000多种植物[1]。据报道，在设施蔬菜栽培中其侵染后可导致减产50%～80%，已成为限制设施蔬菜产业发展的重要障碍因素之一[2]。根结线虫主要以侵染葫芦科、茄科和十字花科植物等为主[3]，尤其近年来随着设施黄瓜栽培面积扩大和复种指数提高，其危害愈来愈严重，一般可致减产20%～30％，严重时高达70％以上，甚至绝收[4-5]。目前，农业生产中较为常见的根结线虫种类有南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、北方根结线虫（M.hapla）、花生根结线虫（M.arenaria）和爪哇根结线虫（M.javanica），其中以南方根结线虫为主[6]。葛俊杰[7]通过形态学和同工酶电泳鉴定发现侵染甘肃榆中县黄瓜的根结线虫种类为南方根结线虫与爪哇根结线虫混合种群。但是，由于根结线虫形态极其相似，因此，应用形态学和同工酶分析很难快速精确鉴定和区别南方根结线虫与爪哇根结线虫[8]。利用PCR技术扩增rDNA-ITS区能够快速诊断和鉴别根结线虫的不同种[9]，并且相关特异性位点已应用于根结线虫种类鉴别，如景晓辉等[10]通过引物＃C2F3/＃1108和MI-F/MI-R建立了适用于几种根结线虫的分子鉴定方法，其中＃C2F3/＃1108可用于区别南方根结线虫或爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫；MI-F/MI-R引物可特异性的区分南方根结线虫和爪哇根结线虫。但是，有关利用线粒体COI基因和多序列特异位点鉴定甘肃榆中县黄瓜根结线虫种类目前尚未见报道。

因此，本试验采用形态学和线粒体COI基因与多序列特异位点相结合的方法对采集的甘肃榆中县黄瓜根结线虫种类进行鉴定，并通过致病性和定殖等方面测定，旨在明确其种类，为后期防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试黄瓜品种为‘超亮116F1，购买于甘肃省农业科学院种子有限责任公司，并种植于温室中，温度为25.0  ℃±0.5  ℃，光照为16/8 h，相对湿度为65%。

供试线虫：2020年10月和2021年5月在甘肃省榆中县黄瓜温室大棚采集带有明显根结的黄瓜根系样品30份，带回实验室保存并进行分离。

1.2 试验方法

1.2.1 黄瓜根结线虫分离 挑选带有明显根结的新鲜黄瓜根系样品，经自来水冲洗干净后置于解剖镜下，利用挑针挑取白色雌成虫和卵囊，并将挑取的卵囊放入筛网，置于装有无菌水的培养皿中，28 ℃孵化3 d后，每隔1 d 收集1次筛网下部无菌水，即获得2龄幼虫。参考段玉玺[11]的方法采用“浅盘法”分离雄成虫。然后将分离的各虫态线虫置于4 ℃保存，以备后续试验。

1.2.2 黄瓜根结线虫形态学鉴定 将收集的雌虫、2龄幼虫和雄成虫各30头、卵30粒分别置于体式显微镜和光学显微镜下观察形态特征并拍照。利用显微镜电脑自带软件ZEN blue测量雌虫、卵、2龄幼虫和雄成虫体长和最大体宽，以及雌虫、2龄幼虫和雄成虫口针长度。然后参考刘维志[3]的方法制备雌虫会阴花纹（图1）。将从根部解剖获得的雌虫置于载玻片，在体式显微镜下按图1的a线切割，并将切取的角质膜移至滴有50%乳酸的载玻片，按图1的b、c线进行切割后，将剩余的形态较完整的角质膜移至滴有甘油的载玻片制片镜检，在光学显微镜下观察其会阴花纹背弓、侧线和花纹等形态特征。

1.2.3 黄瓜根结线虫分子生物学鉴定 从保存的新鲜植物根结组织中挑取单头雌虫，参考万新龙等[12]方法提取其DNA。参考罗龙辉等[13]方法利用通用引物和特异性引物进行PCR扩增（表1）。经扩增后进行电泳检测，并将检测合格的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。测序所得序列采用生物学软件DNAMAN进行拼接后上传至NCBI数据库进行BLAST比对分析，下载对比结果中相似度较高的序列并基于邻接法 （Neighbor-joining） 和利用MEGA X软件构建系统发育树，系统发育树各分支置信度（bootstrap）均进行1  000次重复检验[14]。

1.2.4 黄瓜根结线虫回接致病性测定

将大小一致且饱满健康的黄瓜种子置于铺有一层经无菌水浸湿滤纸的培养皿中催芽。待萌芽后，选取发芽一致的种子种植于装有500 mL无菌土的花盆中，共种植12盆，每盆1棵种子。待黄瓜幼苗生长至三叶一心期时，取其中6盆在其根际土壤3 cm处接种10 mL浓度为500条/mL的2龄幼虫悬浮液，其余6盆接种等量无菌水作为对照。待接种30 d后，观察处理和对照植株的发病情况，以及检查其发病症状是否与田间发病症状一致，并再次从发病植株根系分离雌虫、卵囊、2龄幼虫和雄成虫，观察其形态是否与温室采集分离的线虫形态一致。

1.2.5 黄瓜根结线虫根系定殖作用测定 待接种2龄线虫30 d后，收集不同处理和对照黄瓜植株的新鲜根系，参考段玉玺[11]方法对其进行染色处理，并置于光学显微镜下观察其在根系定殖情况。

1.2.6 数据分析 采用Excel 2010进行数据处理，并采用SPSS 24.0软件和Duncan氏新复极差法进行数据统计分析和多重比较（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 黄瓜根结线虫不同虫态形态及雌虫会阴花纹形态观察

结果表明，从采集的30份样品中，均分离获得了线虫卵、雌雄成虫，并孵化出大量2龄幼虫，观察发现30份样品中分离的不同虫态线虫形态一致。卵无色透明，椭圆形（图2-A）；2龄幼虫呈蠕虫型，体环小而清晰，辱盘略高于中辱，口针纤细（图2-B），尾部透明稍尖（图2-C）；雌虫白色透明呈梨形，具有突出的颈，口针纤细，基部呈卵圆形（图2-D，2-E）；雄虫线形，头冠高圆，口针较粗，尾端较细，钝圆（图2-G，2-H）。参考伏召辉等[18]的研究，初步鉴定为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。同时，显微观察发现，雌虫会阴花纹均近圆形，背弓较高，顶部较平，近梯形，侧线不明显，背面和侧面花纹多呈锯齿状并有分叉，有少数线纹且较平滑（图2-F）。根据观察的会阴花纹特征，并参考罗佳等[19]关于雌虫会阴花纹的描述，可见30份样品中雌虫会阴花纹形态均与南方根结线虫会阴花纹形态特征一致。

2.2 黄瓜根结线虫形态指标测定

研究结果表明，所检30头线虫的卵、2龄幼虫、雌虫、雄成虫的形态测量值均与伏召辉等[18]报道的南方根结线虫虫体形态测量值一致（表2）。

2.3 分子生物学鉴定

采用线粒体COI基因通用引物COI-F/R进行PCR扩增，扩增产物电泳条带清晰完整（图3-A），经测序其片段大小为408 bp，与预测片段长度一致。然后将所得序列提交至NCBI基因库中进行序列对比，并构建系统发育树，发现所鉴定的黄瓜根结线虫GSYZ与已报道的南方根结线虫台湾株系（M.incognita， KU517167.1）聚为一类，其相似性为99.75%，并且与M.hapla、M.mali、M.javanica等其他不同种线虫具有明显差异（图4-A）。

基于南方根结线虫和爪哇根结线虫、花生根结线虫、象耳豆根结线虫特异性引物进行PCR扩增，结果发现只有南方根结线虫特异性引物扩增出完整条带（图3-B），经测序其片段长度为767 bp，与预测片段长度一致，但是其他特异性引物均未扩增获得条带。然后，将南方根结线虫特异性引物扩增获得的序列提交至NCBI基因库中进行序列比对，并构建系统发育树发现黄瓜根结线虫GSYZ与南方根结线虫孟加拉国株系（M.incognita， MN196556.1）和印度株系（M.incognita， MN728679.1）聚为一类，其相似性分别为100%和96.91%（图4-B）。

2.4 黄瓜根结线虫回接致病性及根系定殖效果

接种2龄幼虫30 d后，与对照相比，处理的黄瓜幼苗根系均形成大量根结（图5-B），解剖根结发现大量雌虫和卵囊，并经组织染色处理发现发病组织中有蠕虫形线虫（图5-D）、雌虫（图5-E）、卵囊和卵（图5-F），且其形态与田间分离的虫体形态一致。然而，对照植株根系生长正常，无根结形成（图5-A），且根系组织未发现雌虫、卵囊和幼虫等（图5-C）。

3 讨论与结论

前期伏召辉等[18]基于根结线虫口针、2龄幼虫、雌虫、雄虫的形态特征和测量值及雌虫会阴花纹的形态特征分析，将采集自陕西杨凌黄瓜的根结线虫鉴定为南方根结线虫；龚浩等[20]通过雌虫会阴花纹形态特征，将采集自南京的黄瓜根结线虫鉴定为南方根结线虫。本试验基于根结线虫不同虫态形态特征、体长和雌虫会阴花纹形态特征等指标将采自甘肃榆中县的黄瓜根结线虫初步鉴定为南方根结线虫，与前期研究结果基本一致。但是，由于根结线虫形态极其相似且雌虫会阴花纹形态存在种内变异等，因此仅仅单一采用形态学鉴定难以准确鉴别其种类[10]。近年来，RFLP、RAPD、SCAR、rDNA-ITS-PCR、AFLP等分子诊断技术已广泛应用于根结线虫鉴定 [9]。罗龙辉等[13]通过相对保守的rDNA-ITS和COI两个位点鉴定了广州桑园桑树根结线虫为象耳豆根结线虫；章淑玲等[21]通过rDNA-ITS位点和多序列特异性引物扩增鉴定了福建黄花倒水莲根结线虫为南方根结线虫；陆秀红等[22]基于ITS和28S rDNA D2D3区两个位点鉴定了广西贺州栀子根结线虫为象耳豆根结线虫，但是已有研究表明，采用rDNA-ITS位点能够区分多种线虫种，但难以区分南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫[23]，以及COI区段相对保守也难以区分南方根结线虫和爪哇根结线虫[9]，故利用rDNA-ITS或COI区段难以精确区分根结线虫的具体种。相关研究表明，多序列特异性位点可鉴定和区分同属不同种线虫[24]。本试验采用形态学和线粒体COI基因与多序列特异位点相结合的方法将采集自甘肃榆中县温室大棚黄瓜根结线虫鉴定为南方根结线虫。刘丹等[25]通过多序列特异性位点将感染内蒙古包头市番茄的根结线虫鉴定为南方根结线虫；曹业凡等[26]通过rDNA-ITS片段与多序列特异性位点相结合方法将侵染四川省蓬溪县九叶青花椒的根结线虫种类鉴定为南方根结线虫。

此外，植物线虫回接试验与染色技术是研究线虫致病性和根系定殖效果的有效手段。本试验经致病性和染色观察发现所鉴定的南方根结线虫不仅能够侵染黄瓜幼苗根系组织，而且能够有效地定殖、生長发育和繁殖。综上所述，将引起甘肃省榆中县黄瓜根结线虫病的病原鉴定为南方根结线虫，但是有关甘肃省其他区域黄瓜根结线虫的种类还有待进一步研究。

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Abstract In order to clarify the species of cucumber root-knot nematode in the greenhouses of Yuzhong county in Gansu province， the species was identified by morphology and molecular biology， and its colonization efficiency in rhizosphere was determined and observed by microscope. The results showed that the cucumber root knot nematodes in Yuzhong county of Gansu had the typical morphological characteristics of Meloidogyne incognita according to the nematodes morphology， size and female perineal pattern. The sequence of mitochondrial COI gene of cucumber root-knot nematode from Yuzhong county was identified as one group with Taiwan strain of M.incognita （KU517167）， and the similarity was 99.75% according to the alignment of mitochondrial COI gene sequence and phylogenetic tree construction. The multiple pair of specific sites sequence was clustered with the sequence of Bangladesh strain of M.incognita （MN196556） and Indian strain of M.incognita （MN728697）， and the similarity was 100% and 96.91%， respectively.  The pathogenicity test found that the cucumbers root was infected and formed a large number of root knots at 30 days after inoculation with the juveniles at the second stages of cucumber root-knot nematodes. A large number of linear worms， females and egg masses were parasitized on the tissues of roots after staining. Microscopic observation showed that the morphology of re-isolated nematodes was consistent with the nematodes that collected from the field. Thus， the cucumber root-knot nematodes in Yuzhong county of Gansu province was identified as M.incognita according to the morphological and molecular characteristics.

Key words Yuzhong county  Gansu  province; Root-knot nematode; Identification; Colonization