植物根部内生细菌多样性及其生防作用研究进展

曹焜+王晓楠+孙宇峰+李振伟+潘冬梅+赵越

摘 要：植物内生细菌广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子等组织器官中，研究植物内生细菌多样性在物种资源开发与利用等方面具有重要意义，近年来内生细菌的作用逐渐受到科研工作者的重视。本文针对植物根部内生细菌多样性、定殖过程及其生防作用等几方面进行综述，旨在深入了解植物根部内生细菌资源，为植物内生菌资源开发利用提供参考。

关键词：根；内生细菌；多样性；定殖；生防作用

中图分类号：S182 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170931001

植物内生菌（endophyte）指能够在健康植物活组织中生存而不引起寄主植物明显病变的一大类微生物，是一个生态学概念，主要包括细菌、真菌和放线菌[1]。其中，内生细菌（endophytic bacteria）是内生菌的重要组成部分，广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子等组织中[1-3]，而根部的内生细菌数量远超过其他组织。研究发现内生细菌具有固氮、促进植物生长、增强植物抗性、生物防治[4-6]等方面的作用。随着农业耕作模式的改革、有机食品需求量增大、人们环保意识的增强，化肥农药减量的同时，生物防治的优势也不断突显出来。目前，王志伟等[7]已从宏观角度对植物内生菌研究的发展及其意义进行总结分析，也有内生菌多样性、内生菌生防作用[8，9]等方面的专题报道，而本文更加细化地从植物根部内生细菌多样性及其生物防治作用2方面进行综述分析，为深入了解内生细菌和生防微生物提供理论参考

1 植物根部内生细菌多样性

植物体内存在大量微生物，其中很大一部分为内生细菌。为此，研究内生细菌多样性不仅可以解析植物内生细菌群落结构、变化规律，还能为功能菌株筛选和鉴定提供理论依据。随着分子生物学技术发展，很大程度上提高微生物检测方法的灵敏度，使得多样性研究成为内生细菌研究的重要组成部分。

内生细菌多样性不仅表现在寄主植物多样性上，还体现在内生细菌种类多样性方面。目前已从水稻[2]、小麦[10]、甜菜[11]等不同植物根组织中发现多种内生细菌，对比发现不同寄主类型和寄主生长环境是影响内生细菌多样性的2个因素。在甜菜生长的幼苗期、叶丛快速生长期、块根增长期和糖分积累期时，根部内生细菌的类群数目分别为66 OTUs、109 OTUs、146 OTUs和95 OTUs[11]，可见在相同环境下生长的同种植物根部，内生细菌的多样性也会随寄主生长阶段的变化而变化。

研究植物根部内生细菌多样性常采用2种方法，分别为培养法和非培养的分子生物学方法。培养法通过选择不同培养基和培养条件筛选出相应的目的微生物，张瑞杰等[12]通过分离纯化法研究香蒲根内生细菌多样性，发现优势菌属是假单胞菌属（Pseudomonas）和拉恩氏菌属（Rahnella）。由于培养法仅能获得环境中1 %～10 %的微生物[13]，即培养法会人为降低植物根部内生细菌多样性。因此，需要结合非培养的分子生物学方法进行研究才能获得更大的突破。Zhang等[14]用T-RFLP和克隆文库技术发现α-变形菌和β-变形菌是大豆根部的优势内生细菌类群，同时也发现一些未知细菌类群。尽管经典的DGGE、T-RFLP和克隆文库等非培养法能用于分析内生细菌多样性和相对丰度，但受其分辨率的制约[15]，一些微量及痕量内生细菌很难被发现。随着测序技术的发展，一些高准确性、高通量、高灵敏度的检测技术被应用在内生细菌多样性检测中。Yu等[16]采用LNA-PCR和454高通量测序方法发现假单胞菌属（Pseudomonas）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和黄杆菌属（Flavobacterium）是大豆内生细菌的主要成员，同时还发现一些数目较少的不可培养内生细菌，进一步说明大豆根内生细菌多样性丰富。

2 植物根内生细菌的定殖

许多细菌不仅存在土壤中，也定殖在植物根部，特定的选择机制使得他们向根际移动并定殖于适宜的植物根部，因此认为根际土壤是植物内生细菌的主要来源[17]。根际土壤中潜在内生菌先吸附在根组织表面[18]，通过自然孔口和伤口等多种孔洞进入根部[17]，通常定殖于木质部导管和细胞间隙中[18]。科研工作者们通过抗生素标记法、免疫学方法、基因标记法以及同位素示踪、组织染色等方法检测内生细菌的定殖过程。其中绿色荧光蛋白（GFP）标记技术以其性能稳定、表达与受体细胞无关、方便检测等优点被许多研究者所采用[19]。郝慧娟等[19]采用GFP法研究枯草芽孢杆菌BSD-2在黄瓜植株内定殖及传导过程，认为枯草芽孢杆菌通过占据有利的生态位而阻止病原菌的进入，从而防止病害的发生。明确内生细菌侵染定殖规律对于相关菌剂的开发与应用是至关重要的，同时也能从分子和细胞水平阐述内生细菌与寄主植物间的互作关系。

3 植物根部内生细菌生物防治作用

生物防治就是利用某种生物或其产物抑制有害生物的方法。其中利用有益微生物，通过生物间竞争作用、拮抗作用、寄生作用、溶菌作用及诱导抗性等，来抑制某些病原物的方法是微生物防治。笔者认为微生物防治主要可以分为“菌-病”和“寄主-病”2個方面。

所谓“菌-病”就是指利用有益微生物通过竞争、抗生、寄生、溶菌等作用去抑制或杀死某些病原物的方式。如表1中的芽孢杆菌，不仅能产β-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶、几丁质酶等分解酶去降解病害真菌的细胞壁；同时还能产生嗜铁素，竞争性抑制病原菌吸收铁元素，从而达到抑制病原菌生长的目的[20]。随着研究的深入，Xu等[21]通过反转录技术、ptsI载体构建和基因敲除法对蜡样芽胞杆菌进行研究，发现ptsI基因能促进蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus strain 0–9）的生物膜形成，增加其在小麦根际的生存和定殖能力，最终促进其对纹枯病菌的抑制作用；同时也证明野生型蜡样芽胞杆菌0–9是防治小麦纹枯病的理想生防菌。因为Xu等[21]的试验是在实验室条件下进行的，所以还需在盆栽或大田条件下对野生型蜡样芽胞杆菌0–9的生防能力进一步的检测分析。目前，生防菌通过产生抗菌素、蛋白酶、纤维素酶、嗜铁素等物质在抑制葡萄霜霉病、梨树腐烂病、烟草黑胫病等[22]方面取得一定突破。但防效单一、需菌量大、环境依赖强等缺点也制约着微生物防治的发展。endprint

而“寄主-病”是指拮抗微生物诱发植物自身抗病机制从而增强植物的抗病能力。如表1中沙雷氏菌[24]，能诱导黄瓜产生系统抗性（induced systemic resistance， ISR）抵抗黄瓜炭疽菌、腐败病等病害。自从Chester[25]于1933年首次报道诱导植物产生免疫力后，ISR作为植物保护的一种新机制逐渐引起人们重视。到目前为止，已有许多植物免疫诱抗剂方面的报道[26]。

4 展望

利用细菌16s rDNA及一些功能基因作为分子标记对植物根部内生菌多样性研究取得一定进展。通过对比发现：16S rDNA是一段耐受环境胁迫的保守序列，一般可鉴定到亚属或属以上的分类单位。通过对16S rDNA的序列对比分析，基本上可以分析出植物根部内生细菌的丰度。若要进一步分析某个属内的细菌组成，则需要结合该属细菌的特异性功能基因[28]。

大量研究发现，不同内生细菌在植物根部的定殖规律各不相同，同时也说明内生细菌在定殖能力、分布位点和定殖數量等方面均有较大差异。也有人将内生细菌与病原菌结合研究，发现他们之间具有很多相似之处，为更加合理利用内生细菌的生防功效提供理论途径。但上述研究大多集中在内生细菌的定殖过程及后续的传导途径部分，尚未对其在寄主体内的传导机制、增殖的影响因素及防病机理等部分做深入研究。

与其他土壤微生物相比，内生细菌长期生活在植物体内，使得其具有更多的生态优势和适应能力[29]。但内生细菌的生物防治过程十分复杂，受病害类型、自然环境、植物种类等多种因素影响。目前，关于生防菌制剂防效差、用量大、用法复杂等问题大量出现。因此，需要在内生细菌定殖、生防能力评价、与寄主关系等方面进行研究；在筛选生防菌时，应当以多种病原菌作为筛选条件，筛选出高效、稳定、易推广的菌株，并将多种菌剂合理的复配使用，来提高内生细菌的综合防效；同时还应结合盆栽及田间试验进行验证，为生防微生物制剂的开发与推广奠定基础。

参考文献

[1]Hallmann J，Quadt-Hallmann A，Mahaffee W F，et al. Bacterial endophytes in agricultural crops[J].Canadian Journal of Microbiology，1997，43（10）：895-914.

[2]Sun L，Qiu F，Zhang X，et al. Endophytic bacterial diversity in rice （Oryza sativa L.） roots estimated by 16S rDNA sequence analysis[J].Microbial ecology，2008，55（3）：415-424.

[3]Romero F M，Marina M，Pieckenstain F L. The communities of tomato （Solanum lycopersicum L.） leaf endophytic bacteria，analyzed by 16S-ribosomal RNA gene pyrosequencing[J].FEMS microbiology letters，2014，351（2）：187-194.

[4]Kandel S L，Herschberger N，Kim S H，et al. Diazotrophic endophytes of poplar and willow for growth promotion of rice plants in nitrogen-limited conditions[J].Crop Science，2015，55（4）：1765-1772.

[5]Ramamoorthy V，Viswanathan R，Raguchander T，et al. Induction of systemic resistance by plant growth promoting rhizobacteria in crop plants against pests and diseases[J].Crop protection，2001，20（1）：1-11.

[6]Rangeshwaran R，Wasnikar A R，Prasad R D，et al. Isolation of endophytic bacteria for biological control of wilt pathogens[J].Journal of biological control，2002，16（2）：125-134.

[7]王志伟，纪燕玲，陈永敢. 植物内生菌研究及其科学意义[J].微生物学通报，2015，42（2）：349-363.

[8]徐亚军. 植物内生菌资源多样性研究进展[J].广东农业科学，2011，38（24）：149-152.

[9]陈泽斌，靳松，张永福，等. 植物内生菌生物防治研究进展及存在的问题[J].昆明学院学报，2014，36（3）：40-42.

[10]Durán P，Acu?a J J，Jorquera M A，et al. Endophytic bacteria from selenium-supplemented wheat plants could be useful for plant-growth promotion，biofortification and Gaeumannomyces graminis biocontrol in wheat production[J].Biology and fertility of soils，2014，50（6）：983-990.endprint

[11]Shi Y W，Yang H，Zhang T，et al. Illumina-based analysis of endophytic bacterial diversity and space-time dynamics in sugar beet on the north slope of Tianshan mountain[J].Applied microbiology and biotechnology，2014，98（14）：6375-6385.

[12]张瑞杰，张琼琼，黄兴如，等. 基于分离培养方法的香蒲根内生细菌多样性[J].湿地科学，2016（2）：201-211.

[13]Ward D M，Weller R，Bateson M M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community [J].Nature，1990，345（6270）：63-65.

[14]Zhang Y Z，Wang E T，Li M，et al. Effects of rhizobial inoculation，cropping systems and growth stages on endophytic bacterial community of soybean roots[J].Plant and soil，2011，347（1-2）：147-161.

[15]Kirk J L，Beaudette L A，Hart M，et al. Methods of studying soil microbial diversity[J].Journal of microbiological methods，2004，58（2）：169-188.

[16]Yu J，Yu Z H，Fan G Q，et al. Isolation and Characterization of Indole Acetic Acid Producing Root Endophytic Bacteria and Their Potential for Promoting Crop Growth[J].Journal of Agricultural Science and Technology，2016，18（5）：1381-1391.

[17]Rosenblueth M，Martínez-Romero E. Bacterial endophytes and their interactions with hosts[J].Molecular plant-microbe interactions，2006，19（8）：827-837.

[18]Tombolini R，Unge A，Davey M E，et al. Flow cytometric and microscopic analysis of GFP-tagged Pseudomonas fluorescens bacteria[J].FEMS Microbiology Ecology，1997，22（1）：17-28.

[19]郝慧娟，劉洪伟，尹淑丽，等. 枯草芽孢杆菌BSD-2的GFP标记及其在黄瓜上的定殖研究[J].华北农学报，2016，31（4）：106-111.

[20]Szilagyi-Zecchin V J，Ikeda A C，Hungria M，et al. Identification and characterization of endophytic bacteria from corn （Zea mays L.） roots with biotechnological potential in agriculture[J].AMB Express，2014，4（1）：26.

[21] Xu Y B，Chen M，Zhang Y，et al. The phosphotransferase system gene ptsI in the endophytic bacterium Bacillus cereus is required for biofilm formation，colonization，and biocontrol against wheat sharp eyespot[J].FEMS microbiology letters，2014，354（2）：142-152.

[22] 程超，赵延存，李红旭，等. 产酶溶杆菌OH11代谢产物HSAF对梨树腐烂病的防治效果[J].中国生物防治学报，2017，33（1）：114-120.

[23] Debode J，Maeyer K D，Perneel M，et al. Biosurfactants are involved in the biological control of Verticillium microsclerotia by Pseudomonas spp[J].Journal of applied microbiology，2007，103（4）：1184-1196.

[24] Press C M，Loper J E，Kloepper J W. Role of iron in rhizobacteria-mediated induced systemic resistance of cucumber[J].Phytopathology，2001，91（6）：593-598.

[25] Chester K S. The problem of acquired physiological immunity in plants[J].The Quarterly Review of Biology，1933，8（3）：275-324.

[26]邱德文. 我国植物免疫诱导技术的研究现状与趋势分析[J].植物保护，2016，42（5）：10-14.

[27]Abdallah R A B，Mokni-Tlili S，Nefzi A，et al. Biocontrol of Fusarium wilt and growth promotion of tomato plants using endophytic bacteria isolated from Nicotiana glauca organs[J].Biological Control，2016（97）：80-88.

[28]Chun J，Bae K S. Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences[J].Antonie van Leeuwenhoek，2000，78（2）：123-127.

[29] Pathak K V，Keharia H. Characterization of fungal antagonistic bacilli isolated from aerial roots of banyan （Ficus benghalensis） using intact‐cell MALDI‐TOF mass spectrometry （ICMS）[J].Journal of applied microbiology，2013，114（5）：1300-1310.

作者简介：曹焜，黑龙江鹤岗人，硕士，研究实习员，研究方向为汉麻育种及汉麻内生菌；王晓楠，黑龙江绥化人，博士，副研究员，研究方向为汉麻育种及组学研究。endprint