子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台的构建及初步应用*

李赛,龚咏晴,向花花,董巍檑,马艳,郭紫芬(南华大学衡阳医学院 .附属第一医院妇产科,.药学院药物药理研究所,湖南衡阳 421001)

子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖道常见的妇科恶性肿瘤之一,近年来其发生率呈上升趋势。第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白(The phosphate and tension homolog,PTEN)基因是继p53基因后新发现的又1个抑癌基因。研究表明,在子宫内膜癌中PTEN基因突变比包括kras和p53在内的其他任何基因都更为普遍[1]。一项对国外子宫内膜癌患者进行PTEN基因缺失情况的研究显示,PTEN基因突变率达50%,是子宫内膜癌相关基因中突变率最高的基因,又被称为子宫内膜癌的管家基因[2]。通过在线查询COSMIC-CGC数据库及国外研究PTEN基因突变谱分析,证实第5外显子与第8外显子突变是其热点突变区域[3-4],但国内目前尚未见针对第8外显子968delA突变情况的报道。由于遗传背景、种族差异、地域等的差异性很大程度影响到了多态性位点基因频率的分布,因此,笔者拟运用本研究所前期研究中成功建立的分子开关技术[5],构建对PTEN基因968delA位点突变进行快速、准确检测的技术平台,并初步探讨中国人群子宫内膜癌患者PTEN基因968delA位点突变情况,以期为国内子宫内膜癌的诊治和早期筛查提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 MD2000D微量紫外分光光度计(英国Biofuture公司),MyCycler普通PCR仪(美国Bio-Rad 公司) 。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209-02)、离心柱形质粒小提试剂盒(D6943-01)购自美国Omega公司,血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)、2×Pfu PCR Master Mix(KP201)、100 bp DNA Ladder(MD101-01)、溴化乙锭购自北京天根公司,琼脂糖、EDTA、Tris(河北宏进化工公司)。大肠埃希菌EColi.DH5α为本实验室保存;突变型质粒和野生型质粒模板由本研究所前期试验中构建。

1.2临床样本 收集2015年5月至2017年1月于南华大学附属第一医院妇产科经手术治疗的子宫内膜癌患者组织样本62例,年龄40～72岁,中位年龄53.5岁,同时收集21例因子宫肌瘤行子宫内膜切除术的正常子宫内膜患者作为对照,年龄27～69岁,中位年龄52岁。所有样本均通过术后病理组织切片确诊,标本置于-80 ℃保存。本研究通过南华大学医学伦理委员会审核批准(NHDX-20150509),所有研究对象均签署知情同意书。

1.3引物设计、合成 根据GenBank 中的PTEN基因DNA序列(NC_000010.11),使用Primer Premier 6.0软件设计PTEN基因968delA突变检测引物,并对其3′末端进行硫化修饰。公共上游引物GTCTTTGTGTTTACCTTTATTCAGA,野生型和突变型下游引物序列分别为TTTGCTTTGTCAAGATCATTTTTTGC和TTTGTCAAGATCATTTTTGTC,其中加粗斜体为硫化修饰碱基。引物由上海生工公司合成,扩增产物大小为349 bp。

1.4DNA提取 按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的说明书提取基因组DNA,用MD2000D微量紫外分光光度计分别测定提取的DNA的浓度(≥5 ng/L)和纯度(A260 nm/A280 nm为1.7～1.9),并置于-20 ℃保存。

1.5正交试验设计 采用 L9(34)正交设计表,以本实验室已经构建的包含PTEN基因968delA位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,分别进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应。L9(34)设计方案以及影响PCR 反应的各因素水平见表1。表1中的9次试验重复3次,PCR反应体系为12.5 μL,除表1中所列因素外,用超纯水补足体积。PCR反应条件:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,退火温度梯度59～61 ℃,72 ℃延伸1 min;72 ℃终延伸5 min;4 ℃保存。PCR产物经30 g/L琼脂糖凝胶电泳分离,用凝胶成像仪扫描并拍照。参考何正文等[19]研究对结果进行计算,根据扩增条带的强弱及杂带的多少作1～9分计分,分数越高表示PCR反应的特异性越好。

表1 PCR正交试验设计表[L9(34) ]

1.6PTEN基因PCR灵敏度试验 以10的倍数分别对968delA位点野生型和突变型重组质粒模板进行稀释,将模板依次稀释为10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7ng/μL,建立9个平行反应体系,检测已经建立的突变敏感性分子开关的PCR灵敏度。

1.7临床样本初步应用 在高保真DNA聚合酶的作用下,用优化好的PCR反应条件对21例正常子宫内膜组织与60例子宫内膜癌组织标本进行分子开关的初步检测应用,根据琼脂糖电泳结果判断待测样本是否含有PTEN基因968delA突变以及突变类型。

2 结果

2.1PTEN基因968delA突变检测技术平台的建立与优化 参照表1各因素水平组成,分别进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,结果显示:以野生型质粒为模板时,968delA位点在4W/4M泳道目的条带清晰,特异性好,分子开关现象最为明显(图1A),根据K值的大小得出的各因素优化水平组合为:循环数为30 个、引物(10 μmol/L)为0.5或0.4 μL、模板DNA为0.3 μL、退火温度为61 ℃。由R值可以得出各因素的重要性顺序为:模板DNA(3)>引物(2.5)=退火温度(2.5)>循环速(2),见表2。当以突变性质粒为模板时,4W/4M、5W/5M、7W/7M泳道特异性好,无杂带,分子开关现象明显(图1B),根据K值的大小得出的各因素优化水平组合为:循环数为30 个、引物为0.5 μL、模板DNA为0.4 μL、退火温度为59 ℃。由R值可以得出各因素的重要性顺序为:引物(4.167)>模板DNA(2.667)>退火温度(1.167)>循环数为3(1),见表3。综合分析后,确定适用于分子开关检测PTEN基因968delA位点突变的最佳PCR反应体系:循环数为30个、模板DNA(10 ng/μL)为0.3 μL、引物(10 μmol/L)为0.5 μL、退火温度为61 ℃。

注:A,野生型质粒模板;B,突变型质粒模板;M,100 bp DNA Marker;1～9表示正交优化后的9次试验,1W～9W表示野生型引物,1M～9M表示突变型引物。图1 PCR正交优化琼脂糖凝胶电泳图

表2 野生型质粒模板968delA位点正交试验结果记录及分析

表3 突变型质粒模板968delA位点正交试验结果记录及分析

2.2PTEN基因968delA突变检测技术平台的灵敏度检测结果 分别将突变型和野生型模板梯度稀释后,琼脂糖凝胶电泳结果见图2,当模板在10～10-3ng/μL时,目的条带清晰可见,且无非特异性条带。

注:A,野生型质粒模板,B,突变型质粒模板;M,100 bp DNA Ladder;1～9,模板浓度梯度分别为10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10 ng/μL。图2 各模板浓度梯度 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图

2.3PTEN基因968delA突变检测技术平台初步临床应用 用优化好的PCR反应体系对收集的21例正常子宫内膜组织与62例子宫内膜癌组织样本进行检测,结果均发现只有野生型引物产生了特异性条带,突变型引物均未产生特异性条带(图3A);测序结果进一步确证样本均未发生968delA位点突变(图3B)。

注:A,分子开关检测部分子宫内膜组织样本PTEN基因968delA位点凝胶电泳图; B,子宫内膜组织样本测序图;M,100 bp DNA Ladder;1～2,正常子宫内膜组织;3～9,子宫内膜癌组织;1W～9W,野生型特异性检测引物;1M～9M,突变型特异性检测引物。图3 分子开关检测PTEN基因的凝胶电泳及测序结果

3 讨论

子宫内膜癌是全球范围内女性生殖系统子宫内膜的常见多发上皮性恶性肿瘤,PTEN基因突变不仅是子宫内膜癌发生的重要致病因素[6-7],同时也是有助于早期子宫内膜癌患者保留生育治疗决策的生物分子和遗传预后因素[8-9]。本研究利用高保真酶介导的突变敏感性分子开关快速筛查点突变的技术平台[10],根据影响PCR的重要因素制定了合理的正交设计方案,从循环数、引物、模板 DNA和退火温度这4个方面来进行突变检测平台优化,得出了同时适用于检测PTEN基因968delA位点野生型和突变型的PCR反应体系,循环数选择30个、模板DNA(10 ng/μL)为0.3 μL、引物(10 μmol/L)为0.5 μL、退火温度为61 ℃。随后,对PCR反应模板灵敏度进行分析发现968delA位点野生型和突变型重组质粒模板浓度在10-3ng/μL 时,均有目的条带,表明本研究建立的突变灵敏度分子开关的灵敏度达10-3ng/μL,因而该技术不仅可以用于组织标本突变的检测,也可以用于简单方便取材的血液游离DNA的检测。

本研究进一步对优化后的子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台的临床实用性进行了初步探讨,并对62例子宫内膜癌组织和21例正常子宫内膜组织样本进行了PTEN基因968delA位点突变检测,均未发现突变,且测序结果也验证了这一检测结果,表明优化的PTEN基因968delA位点缺失突变检测技术平台可以用于临床样本的筛查,本研究的样本中并未检测到PTEN基因968delA位点缺失突变,这可能与样本量有限且来源单一以及中国人不同的遗传背景有关。

本研究成功建立了子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台。但有限的样本量可能影响对子宫内膜癌PTEN基因968delA突变的检出,后续笔者将继续收集临床子宫内膜癌患者样本进一步检测;也可以进一步筛查PTEN基因的其他突变,并对其与子宫内膜癌的相关性进行分析,为国内研究PTEN基因突变的检测提供临床前研究基础数据。综上所述,该平台的灵敏度较高,可以进一步用于血液样本游离DNA的检测以实现子宫内膜癌早诊断与早治疗,为促进肿瘤基因诊断应用于临床医疗拓宽新视野,甚至可能成为提高临床用药敏感性的依据。