葛根素对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的作用机制研究

孙辉 刘翠玲 姚静 何秋婷 谢月 梁奇

〔摘要〕 目的 探討葛根素（puerarin， PUE）在脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎作用，并揭示其分子机制。方法 采用CCK-8比色法分别设置不同浓度的LPS和PUE，观察对RAW264.7细胞活性的影响，筛选出合适的LPS造模浓度及PUE的给药浓度。将细胞分为正常对照组、模型组（1 μg/mL）、PUE给药组（12.5、25、50 μmol/L）。Griess法检测一氧化氮（nitric oxide， NO）释放量；ELISA法检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）的含量；qRT-PCR法检测环氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2） mRNA水平；Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）、COX-2、p-IκBα、p-p65蛋白表达水平。结果 与正常对照组比较，不同浓度的LPS诱导24 h，RAW264.7细胞存活率降低，但对细胞增殖无影响（P＞0.05），PUE在浓度100 μmol/L及以下时对RAW264.7细胞增殖也无影响（P＞0.05）；与模型组相比，PUE给药组（12.5、25、50 μmol/L）NO、TNF-α、IL-1β及IL-6的释放量显著降低（P<0.01），COX-2的蛋白及mRNA表达水平显著降低（P<0.05），iNOS、p-IκBα、p-p65的蛋白表达水平呈浓度依赖性降低（P<0.01）。结论 PUE的体外抗炎作用机制与抑制核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）信号通路相关。

〔关键词〕 葛根素；脂多糖；RAW264.7细胞；炎症；一氧化氮；一氧化氮合酶；NF-κB信号通路

〔中图分类号〕R285.5      〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.008

Anti-inflammatory effects and mechanisms of Puerarin on LPS-induced RAW264.7 macrophages

SUN Hui， LIU Cuiling， YAO Jing， HE Qiuting， XIE Yue， LIANG Qi*

Bao'an TCM Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Shenzhen， Guangdong 518101， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the anti-inflammatory potential of Puerarin （PUE） in lipopolysaccharide （LPS）-induced RAW264.7 macrophages and reveal its potential molecular mechanisms. Methods The effects of different concentrations of LPS and PUE on the viability of RAW264.7 cells were determined by CCK-8 colorimetric method， and the appropriate LPS modeling concentration and PUE administration concentration were screened. Cells were divided into normal control group， model group （1 μg/mL）， and PUE administration group （12.5， 25， 50 μmol/L）; Griess assay was used to assess the nitric oxide （NO） concentration; tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6） content was measured by ELISA; cyclooxygenase-2 （COX-2） mRNA levels were detected by qRT-PCR; the protein expression levels of inducible nitric oxide synthase （iNOS）， COX-2， p-IκBα， and p-p65 were determined by Western blot. Results Compared with the normal control group， the survival rate of RAW264.7 cells decreased after 24 h of LPS induction at different concentrations， and there was no effect on cell proliferation （P>0.05）， PUE has no significant cytotoxic effects at or below the concentrations of 100 μmol/L （P>0.05）; Compared with the model group， PUE administration group （12.5， 25， 50 μmol/L） displayed favorable inhibitory effects on the release level of NO， TNF-α， IL-1β and IL-6 （P<0.01）， and the protein and mRNA expression levels of COX-2 significantly decreased （P<0.05） in LPS-induced RAW264.7 cells， and it is the same for the expression levels of iNOS， p-IκBα， p-p65 （P<0.01）. Conclusion The anti-inflammation mechanisms of PUE is related with nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 puerarin; lipopolysaccharide; RAW264.7 cells; inflammation; nitric oxide; inducible nitric oxide synthase; NF-κB signaling pathway

炎症是机体对有害刺激（如病原体、受损细胞或刺激物）的复杂生物反应。炎症反应导致疼痛、发热、瘙痒、红胀，甚至诱发过敏、哮喘及肿瘤等[1-2]。炎症介导的关键因子核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）是Toll样受体（Toll-like receptor， TLR）通路中的重要信号分子。这些因子的调节被广泛认为是抑制各种炎症的良好策略。更具体地说，NF-κB是促炎基因转录调节的一个重要因素，如白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、一氧化氮（nitric oxide， NO）诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）和环氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2），也是NF-κB激活所必需的[3-4]。因此，NF-κB活化与炎症性疾病密切相关，针对NF-κB的抗炎药物的开发备受关注。

中药葛根是解表退热的代表性药物之一，广泛应用于治疗临床炎症性疾病，如发热[5]、疼痛[6-10]及类风湿关节炎[11-12]等。葛根素（puerarin， PUE）是葛根的主要有效成分，虽然其抗炎活性已有报道[13]，但是PUE的抗炎活性所涉及的细胞机制仍有待阐明。本研究通过将PUE作用于脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，研究PUE抗炎症反应的作用及机制，为其进一步的开发及临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1  细胞及药品

小鼠RAW264.7巨噬细胞购自中国科学院武汉分院细胞库。PUE（上海诗丹德标准服务技术有限公司，批号：110752-202013，纯度≥98%）；LPS（美国Sigma-Aldrich公司，批号：#028M4094V）。

1.2  主要试剂

CCK-8试剂盒（北京兰杰柯科技有限公司，批号：21266840）；胎牛血清（德国Nobimpex公司，批号：A115-500）；DMEM培养基、PierceTM BCA蛋白检测试剂盒（上海赛默飞世尔科技公司，批号：8122524、WK342259）；UltraSYBR Mixture PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技股份有限公司，批号：CW2601M）；cDNA反转录试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，批号：H8203980）；iNOS（上海Abcam公司，批號：ab178945）；COX-2（批号：37843）、p-IκBα（批号：2859S）、IκBα（批号：4814S）、p65（批号：8242S）及p-p65（批号：3033S）均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3  主要仪器

CO2细胞培养箱、高速冷冻离心机（上海赛默飞世尔科技有限公司，型号：371、Sorvall ST 16R）；蛋白电泳仪（上海伯乐生命医学产品有限公司，型号：Bio-Rad 1658029）；化学发光荧光成像仪（上海天能科技有限公司，型号：5200Multi）；医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司，型号：HYC-198S）；洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-2FD）。

2 方法

2.1  细胞培养及传代

RAW264.7细胞在37 ℃下于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM中培养，细胞在37 ℃、5% CO2空气环境中生长。待细胞密度长至90%时进行传代，用细胞刮刀将贴壁细胞刮下，然后吹匀使细胞成单个悬浮状态，再转移至15 mL离心管，1000 r/min（离心半径8 cm），离心5 min，弃上清液，加入新的培养基重悬，按照1∶3进行接种。

2.2  细胞分组及细胞存活率检测

取对数生长的细胞，按照1×106个/mL接种于6孔板，设置正常对照组、模型组（0.01、0.1、1、10 μg/mL）、PUE给药组（7.5、12.5、25、50、100 μmol/L）。待细胞贴壁过夜，正常对照组加入新鲜培养基，PUE给药组加入不同浓度PUE，每组设3个复孔，培养24 h；每孔加入20 μL CCK-8，放入细胞培养箱内继续孵育4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度（OD）值，计算细胞存活率。

2.3  细胞上清液中NO释放量的检测

取对数生长期的细胞，按照1×106个/mL接种于96孔板，设置正常对照组、模型组（1 μg/mL）、PUE给药组（12.5、25、50 μmol/L），待细胞贴壁过夜，PUE给药组加入PUE预处理0.5 h，除正常对照组，其余各组加入LPS（1 μg/mL）培养24 h。吸取各组细胞上清液50 μL，与Griess试剂混合，并在室温下孵育15 min。使用NaNO2作为标准，在540 nm波长处测定NO浓度。

2.4  细胞上清液中炎性细胞因子的检测

取对数生长期的细胞，按照1×106个/mL接种于6孔板，分组及处理同“2.3”，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书定量检测培养基中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-6的含量。

2.5  COX mRNA水平的检测

细胞分组及给药方法同“2.3”，收集细胞，使用TRIzol试剂提取总RNA，应用逆转录试剂盒制备cDNA。所有引物均由上海Invitrogen公司合成，使用Primer-BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）平台设计COX-2、GAPDH引物序列（见表1）。使用RT-PCR试剂盒在罗氏LightCycler480实时系统（德国Roche Diagnostics公司）中进行qRT-PCR分析。

2.6  iNOS、COX-2、NF-κB信号通路蛋白表达的检测

细胞分组及给药方法同“2.3”，待细胞贴壁过夜，各給药组加入PUE预处理0.5 h，除正常对照组，其余各组加入LPS（1 μg/mL）培养30 min，收集细胞，加入含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解液冰浴裂解30 min，在4 ℃条件下12 753 r/min离心15 min，离心半径8 cm；收集上清后，按照BCA蛋白定量试剂盒说明进行蛋白定量，吸取部分蛋白液与5×蛋白质上样缓冲液混匀，97 ℃金属浴煮5 min，通过10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分离蛋白质提取物，并转移至PVDF膜。脱脂奶粉封闭2 h，再加入iNOS、COX-2、p-IκBα、IκBα、NF-κB/p65、p-p65抗体稀释液，4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤3次，并与在封闭溶液中稀释的过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育2 h，洗涤后，使用ECL发光液检测蛋白质。

3 结果

3.1  LPS对RAW264.7细胞活性的影响

为了评估LPS对RAW264.7细胞的细胞毒性作用，将细胞与不同浓度的LPS（0.01、0.1、1、10 μg/mL）孵育24 h。CCK-8结果显示，与正常对照组比较，在24 h内，LPS的浓度为0.01、0.1、1、10 μg/mL时，RAW264.7细胞存活率降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），说明各浓度下LPS对细胞无毒性或毒性不明显。详见表2。

3.2  PUE对RAW264.7细胞活性的影响

为了评估PUE对RAW264.7细胞的细胞毒性作用，将细胞与不同浓度的PUE（7.5、12.5、25、50、100 μmol/L）孵育24 h。CCK-8结果显示，与正常对照组比较，在24 h内，PUE给药组浓度为7.5、12.5、25、50、100 μmol/L时，RAW264.7细胞存活率逐渐降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），说明各浓度下PUE对细胞无毒性或毒性不明显。详见表3。最后，选择12.5、25、50 μmol/L作为PUE的给药浓度，用于进一步研究。

3.3  LPS对RAW264.7细胞中炎症因子表达的影响

与正常对照组比较，除模型组（0.01 μg/mL）外，其余3个浓度（0.1、1、10 μg/mL）均可明显诱导RAW264.7细胞产生炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6（P＜0.05），并呈现一定的浓度依赖关系。但由于1 μg/mL和10 μg/mL浓度之间诱导炎症因子水平差异无统计学意义（P＞0.05），故选择1 μg/mL的LPS作为造模浓度。详见表4。

3.4  PUE对LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症因子表达的影响

与正常对照组比较，模型组上清液中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，PUE给药组上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平呈浓度依赖性降低（P＜0.05）。详见表5。

3.5  PUE对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO和iNOS表达的影响

与正常对照组比较，模型组中NO的产生以及iNOS的表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，PUE给药组LPS诱导的RAW264.7中NO的产生以及iNOS的蛋白表达水平降低（P＜0.05）。详见表6、图1。

3.6  PUE对LPS诱导的RAW264.7细胞中COX-2表达的影响

与正常对照组比较，模型组中COX-2的mRNA和蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，PUE给药组COX-2的mRNA和蛋白表达明显降低（P＜0.05）。详见图2、表7。

3.7  PUE对NF-κB信号通路的影响

与正常对照组比较，模型组NF-κB信号通路中p-p65和p-IκBα表达明显增加（P＜0.05）；与模型组相比，PUE给药组p-p65和p-IκBα水平呈浓度依赖性降低（P＜0.05）。详见图3。

4 讨论

炎症是病原体、受损细胞或刺激物攻击机体产生的基本防御机制。炎症反应有多种生理目的，如宿主防御、组织修复反应和稳态恢复。然而，这种反应会产生病理后果，导致炎症组织损伤、化生和稳态设定点的改变。因此，机体需要对炎症反应进行适当的调节。一些有害刺激，如病原体、受损细胞或刺激物可刺激机体产生NO，但过量产生NO会在巨噬细胞中诱导慢性炎症反应[14]。慢性NO过量产生也涉及其他负面的细胞生理功能，如DNA损伤和诱变[15]。在本研究中，PUE抑制LPS刺激的RAW264.7细胞中NO的产生。其次，PUE还以剂量依赖的方式抑制LPS诱导的iNOS蛋白水平升高。这些结果表明，PUE可能是一种潜在的抗炎化学物质。前列腺素（prostaglandin， PG）是来源于花生四烯酸的类脂化合物。NO、iNOS和PG维持体内平衡功能并介导致病机制，包括炎症反应。由促炎刺激物、细胞因子、激素和生长因子诱导的COX-2是炎症中PG形成的重要来源[16-18]。COX-2酶抑制剂被开发用于治疗与关节炎相关的炎症[19-20]和疼痛[21-22]。促炎细胞因子往往会通过诱发机体产生发热、炎症、组织破坏或全身炎症使疾病恶化。IL-6是一种关键的炎症细胞因子，在诱导下游炎症反应中起着重要作用。在这项研究中，我们发现PUE抑制LPS诱导的TNF-？琢、IL-1？茁和IL-6的上调。PUE处理以剂量依赖的方式减少LPS诱导的NO释放。此外，PUE下调LPS诱导的iNOS、COX-2、p-IκBα、p-p65的表达。NF-κB可与κB的抑制剂IκBα结合，当给予诱导炎症反应的刺激时，NF-κB被IκBα降解激活，并导致其易位到细胞核中，以促进炎症基因的表达，包括iNOS、COX-2和IL-6。

综上所述，体外实验表明PUE可能是一种具有潜在抗炎作用的天然活性化合物，可以抑制炎症因子的产生以及炎症反应，这种抑制作用可能与调控NF-κB信号通路密切相关。本研究结果可为PUE用于治疗相关炎症性疾病以及进一步的研究利用提供科学参考。

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〔收稿日期〕2022-11-25

〔基金項目〕广东省粤深青年联合基金项目（2019A1515111192）。

〔第一作者〕孙  辉，男，硕士研究生，研究方向：中药药理研究。

〔通信作者〕*梁  奇，男，主任中药师，E-mail：liangqi70@gzucm.edu.cn。