吴茱萸碱调控PI3K/AKT信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖和诱导凋亡

郭利培 刘洁 张文青 史红健 范婧莹 王贤文 何迎春

〔摘要〕 目的 研究吳茱萸碱对鼻咽癌5-8F细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响。方法 （1）将5-8F细胞分为溶剂对照组、不同浓度吴茱萸碱组（0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1）、顺铂组（cisplatin，4.0 μg·mL-1）；（2）将5-8F细胞设为5组：溶剂对照组、SC79 2.5 μmol·L-1组、SC79+吴茱萸碱 2.0 μmol·L-1组 、吴茱萸碱 2.0 μmol·L-1组、LY294002 50 μmol·L-1组。采用实时无标记细胞功能分析仪（real time cellular analysis technology， RTCA）监测细胞增殖的情况；Annexin V-FITC/PI双荧光染色法检测细胞凋亡率，Hoechest 33342染色法观察细胞凋亡形态；Western blot法检测磷酸肌醇3-激酶蛋白（phosphatidylinositol 3-kiases， PI3K）、磷酸化蛋白质激酶蛋白B（phosphorylated protein kinase B， p-AKT）、增殖细胞核抗原蛋白（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）、X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis， XIAP）、存活蛋白（Survivin）的表达水平。结果 与溶剂对照组相比，不同浓度吴茱萸碱组（0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1）显著抑制5-8F细胞增殖（P＜0.05或P<0.01）；吴茱萸碱组（1.0、2.0 μmol·L-1）的细胞核荧光染色增强，凋亡率明显升高（P<0.01）；PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin蛋白表达水平明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。与吴茱萸碱2.0 μmol·L-1组比较，SC79+吴茱萸碱2.0 μmol·L-1组的PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin蛋白表达水平升高（P＜0.05或P＜0.01），且吴茱萸碱抑制5-8F细胞增殖和诱导凋亡的效应降低（P＜0.05或P＜0.01）。结论 吴茱萸碱可能通过抑制PI3K/AKT信号通路活性，下调增殖及凋亡相关蛋白PCNA、XIAP、Survivin的表达水平，最终抑制鼻咽癌细胞增殖和诱导凋亡。

〔关键词〕 鼻咽癌细胞；吴茱萸碱；增殖；凋亡；PI3K/AKT信号通路

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.006

Regulation of evodiamine on PI3K/AKT signaling pathway to inhibit proliferation and

induce apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells

GUO Lipei1， LIU Jie1， ZHANG Wenqing1， SHI Hongjian1，2，3， FAN Jingying1，2，3， WANG Xianwen2，3，4*， HE Yingchun1，2，3*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Provincial Ophthalmology and Otolaryngology Diseases Prevention and Treatment with Chinese Medicine and Visual Function Protection Engineering and Technological Research Center， Changsha， Hunan 410208， China; 4. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of evodiamine on proliferation and apoptosis of 5-8F cells in nasopharyngeal carcinoma cells and the role of PI3K/AKT signaling pathway. Methods The 5-8F cells were divided into solvent control group， evodiamine （0.5， 1.0， 2.0， 4.0 μmol·L-1） groups and cisplatin （4.0 μgmol·L-1） group; in addition， the 5-8F cells were divided into 5 groups： solvent control group， SC79 （2.5 μmol ·L-1） group， SC79+evodiamine （2.0 μmol·L-1） group， evodiamine （2.0 μmol·L-1） group， and LY294002 （50 μmol·L-1） group. The cell proliferation was monitored by real time cellular analysis technology （RTCA）， the apoptosis rate was detected by annexin V-FITC/PI double fluorescence staining， and the apoptosis morphology was observed by Hoechest 33342 staining. The expression levels of phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）， phosphorylated protein kinase B （p-AKT）， proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， X-linked inhibitor of apoptosis （XIAP） and Survivin were detected by Western blot. Results Compared with the solvent control group， different concentrations of evodiamine （0.5， 1.0， 2.0， 4.0 μmol·L-1） significantly inhibited the proliferation of 5-8F cells （P<0.05 or P<0.01）， and the nuclear fluorescence staining and apoptosis rate of cells in evodiamine group （1.0， 2.0 μmol·L-1） increased significantly （P<0.01）. The protein expression of PI3K， p-AKT， PCNA， XIAP and Survivin decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with evodiamine （2.0 μmol·L-1） group， the protein expression levels of PI3K， p-AKT， PCNA， XIAP and Survivin in SC79+evodiamine （2.0 μmol·L-1） group were elevated （P<0.05 or P<0.01）， and the effects of evodiamine on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of 5-8F cells decreased （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Evodiamine may inhibit proliferation and induce apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells by inhibiting the activity of PI3K/AKT signaling pathway and down-regulating the expression of proliferation and apoptosis-related proteins PCNA， XIAP and Survivin.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 nasopharyngeal carcinoma cell; evodiamine; proliferation; apoptosis; PI3K/AKT signaling pathway

鼻咽癌是由鼻咽部鳞状上皮黏膜病变引起的头颈部恶性肿瘤之一，其发病具有明显的地域倾向和性别差异，中国鼻咽癌的发病率约占全球的50%[1]。由于头颈部器官结构复杂，且鼻咽癌的好发部位咽隐窝位置隐匿，发病初期无特异性表现，因此，鼻咽癌的早期发现和传统手术治疗成为了医学上的难点。近年来，调强放疗使鼻咽癌治愈率显著提高，但很多患者出现术后不耐受，生活质量受到严重影响[2]。因此，寻找安全有效的抗鼻咽癌药物仍然是当前医学领域亟待解决的难题。

中药因其治疗作用广泛并且毒副作用小，在肿瘤的治疗中取得良好效果，中药单体为中药的有效提取物，其抗肿瘤活性成分的基础研究也成为了当前研究的热点[3]。吴茱萸碱（evodiamine）是从芸香科植物吴茱萸中提取出的一种吲哚喹唑啉生物碱。研究表明，吴茱萸碱对人甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌等多种肿瘤细胞有抑制作用[4-6]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinases， PI3K）/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（serine threonine protein kinase， AKT）信号通路是细胞内重要的生存信号通路之一，已有研究报道，PI3K/AKT信号通路在多数肿瘤中存在异常激活，并且吴茱萸碱能够通过PI3K/AKT信号通路抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡[7-12]。在鼻咽癌中，尚无吴茱萸碱对PI3K/AKT信号通路影响的报道。本实验旨在通过研究吴茱萸碱对鼻咽癌5-8F细胞增殖、凋亡的影响，并探讨PI3K/AKT信号通路在吴茱萸碱抗鼻咽癌中的作用，初步阐明吴茱萸碱抗鼻咽癌的部分分子机制。

1 实验材料

1.1  细胞株

人高转移鼻咽癌5-8F细胞株（批号：BNCC341932）购自商城北纳创联生物科技有限公司，由本实验室传代培养。

1.2  主要试剂与药物

RPMI-1640培养基（批号：WH0022X041）、青霉素-链霉素混合液（批号：WH0621K6）、胰蛋白酶-EDTA消化液（批号：20220115，北京索莱宝公司）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清（批号：2204031，美国Gibco公司）；BCA蛋白定量試剂盒（批号：A11244，北京康为世纪生物科技有限公司）；Hoechst 33342染色液（批号：20210818，北京索莱宝公司）；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒（批号：70-AP101-100，美国BD公司）；顺铂（cisplatin，批号：MKCM2435，美国Sigma公司）；对照品吴茱萸碱（批号：23743，质量分数≥99.86%）、SC79（批号：#17945）、LY294002（批号：#51598）均购自MCE公司；PI3K抗体（批号：10）、p-AKT抗体（批号：25）、增殖细胞核抗原蛋白PCNA抗体（批号：7）、Survivin抗体（批号：15）、XIAP抗体（批号：5）、GAPDH抗体（批号：8）均购自CST公司；山羊抗兔荧光二抗（批号：C70426-05）、山羊抗小鼠荧光二抗（批号：D00115-03）购自LICOR公司。

1.3  主要仪器

CO2培养箱（型号：HERAcell150i，赛默飞世尔公司）；全自动酶标分析仪（型号：ELX800，BioTek公司）；实时无标记细胞分析仪（real time cellular analysis technology， RTCA，型号：xCELLigence RTCA DPlus， 艾森生物科技公司）；双荧光细胞分析仪（型号：Cellometer K2， Nexcelom Bioscience公司）；细胞成像多功能检测系统（型号：CytationTM 5，BioTek公司）；双红外荧光成像系统（型号：Odyssey CLX，LICOR公司）；台式高速冷冻离心机（型号：Microfuge 20R，Beckman Coulter公司）。

2 实验方法

2.1  细胞培养及药物配制

将鼻咽癌5-8F细胞培养于37 ℃、5% CO2、湿度饱和的培养箱中，待细胞密度达到80%以上，取对数生长期细胞用于后续实验。吴茱萸碱粉末用DMSO溶解，配制成200 mmol·L-1的储备液，避光保存于-80 ℃冰箱，使用时用含10%胎牛血清、90% RPMI-1640培养基的完全培养基稀释。

2.2  实时无标记细胞分析仪监测细胞增殖

参考胡晶等人[13]的方法，将5×103个/100 μL的细胞悬液接种于RTCA专用板，在细胞生长曲线进入平台期之前加入不同浓度吴茱萸碱（0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1），继续监测细胞增殖。机制部分以SC79为PI3K/AKT信号通路激活剂，LY294002作为信号通路抑制剂，分组设置为溶剂对照组、SC79 2.5 μmol·L-1组、SC79+吴茱萸碱2.0 μmol·L-1组、吴茱萸碱 2.0 μmol·L-1组、LY294002 50 μmol·L-1组。实验均重复3次。

2.3  Annexin V-FITC/PI双荧光染色法检测细胞凋亡率

根据RTCA监测结果，发现吴茱萸碱1.0、2.0 μmol·L-1的浓度抑制细胞增殖效果较好，因此设置分组为溶剂对照组、吴茱萸碱1.0 μmol·L-1、吴茱萸碱2.0 μmol·L-1组、顺铂组 4.0 μg·mL-1，检测凋亡率；机制部分分组同“2.2”项。

干预细胞24 h后收集上清液于EP管，用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞，加入2 mL全培终止消化，将细胞悬液收集到含有上清液的EP管，离心弃去上清液，用PBS重悬转移至新的1.5 mL EP管，继续离心去上清，加入100 μL 1×Binding Buffer轻轻吹打重悬，分别加入annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL染色液避光染色15 min，再加入100 μL 1×Binding Buffer终止染色。使用双荧光细胞分析仪检测凋亡率，实验重复3次。

2.4  Hoechst 33342染色法观察细胞凋亡形态

常规消化细胞后接种于6孔板，细胞贴壁后弃除上清液加入不同浓度吴茱萸碱1.0、2.0 μmol·L-1。培养24 h，弃上清，用PBS清洗2次，于每孔加入1 mL 10 mg·L-1的Hoechst 33342染色工作液，避光孵育20 min，PBS洗涤2次。CytationTM 5观测细胞形态并拍照，实验重复3次。

2.5  Western blot检测PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin表达水平

药物分组同“2.3”项，干预细胞24 h后，提取总蛋白定量，配制蛋白样品、凝胶分离体系，将蛋白样品加入泳道，在浓缩胶中采用40 V电压浓缩，进入分离胶后加压至80 V分离，200 mA恒流转膜2.5 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗置于4 ℃冰箱孵育过夜，二抗室温避光孵育1.5 h。双色红外荧光成像系统进行扫膜，并用Image Studio分析条带信号值，实验重复3次。

2.6  统计学分析

使用SPSS 26.0软件分析数据，计量资料用“ｘ±s”表示，多组间比较服从正态分布，采用单因素方差分析，组间方差齐时用LSD检验，方差不齐，选择Games-Howell（A）检验；不服从正态分布资料，采用秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1  吴茱萸碱对鼻咽癌5-8F细胞增殖的影响

与溶剂对照组相比，不同浓度（0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1）吴茱萸碱组的细胞增殖曲线降低，且细胞相对增殖率显著低于溶剂对照组（P＜0.05或P＜0.01），表明吴茱萸碱能够抑制5-8F细胞增殖。详见图1。

3.2  吴茱萸碱对鼻咽癌5-8F细胞凋亡率的影响

与溶剂对照组比较，吴茱萸碱组细胞凋亡率明显提高（P＜0.01）（见表1和图2）。Hoechst 33342染色结果显示，吴茱萸碱组细胞核亮蓝色荧光增强，细胞核边缘不清晰，核内出现点状式破碎等凋亡特征（见图3）。

3.3  吴茱萸碱对鼻咽癌5-8F細胞PI3K/AKT信号通路和增殖、凋亡相关蛋白表达水平的影响

与溶剂对照组比较，吴茱萸碱1.0 μmol·L-1组p-AKT、Survivin蛋白表达下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），PI3K、XIAP、PCNA明显降低（P＜0.01）；吴茱萸碱2.0 μmol·L-1组PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01）。详见图4。

3.4  吴茱萸碱通过PI3K/AKT信号通路对鼻咽癌细胞增殖凋亡的影响

与溶剂对照组相比，PI3K/AKT信号通路激活剂（SC79）能够提高PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin的表达水平（P＜0.01或P＜0.05），而PI3K/AKT信号通路抑制剂（LY294002）能够降低PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin的表达水平（P＜0.01）。与吴茱萸碱2.0 μmol·L-1组比，激活剂联合药物（SC79+吴茱萸碱2.0 μmol·L-1）组的PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin表达水平升高（P＜0.01或P＜0.05）（见图5）。使用PI3K/AKT信号通路激活剂后，与吴茱萸碱2.0 μmol·L-1组相比，SC79+吴茱萸碱2.0 μmol·L-1组细胞的增殖曲线升高，且细胞增殖率增加（P＜0.01或P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.01）（见表2、图6-7）。

4 讨论

鼻咽癌发生位置隐蔽，前期症状不典型，如何实现鼻咽癌的精准诊治，制订“高效低毒”的治疗方案，仍是亟待解决的问题。中药单体对抑制鼻咽癌细胞恶性生物学行为具有一定的抑制作用，本课题组前期研究发现黄芩苷能够促进自噬[14]；刘洁等[15]发现黄芩苷能够通过调控TGF-β1/ERK1/2信号通路抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖；周芳亮等[16]证实小檗碱联合人参皂苷可协同抑制鼻咽癌细胞迁移。

X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein， XIAP）在鼻咽癌中呈高表达，抑制XIAP蛋白的表达能够促进鼻咽癌细胞的凋亡[17]，存活蛋白Survivin具有抗凋亡及促进增殖作用，研究表明，抑制Survivin的表达能够减缓鼻咽癌细胞增殖活性，并加快肿瘤细胞的凋亡进度[18]。增殖细胞核抗原蛋白（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）可促进DNA复制与修复，促使肿瘤细胞增殖，在肿瘤中能够反映肿瘤细胞增殖活性[19]。本实验通过RTCA证实了不同浓度吴茱萸碱能够抑制鼻咽癌细胞增殖，在吴茱萸碱作用下，细胞核亮蓝荧光染色增强，胞核边界模糊，细胞凋亡率升高，并且吴茱萸碱下调了鼻咽癌5-8F细胞中XIAP、Survivin、PCNA的表达水平，提示吴茱萸碱抑制鼻咽癌增殖和诱导凋亡的效应可能与抑制XIAP、Survivin、PCNA蛋白的表达相关。PI3K/AKT信号通路是细胞内重要的信号通路之一，人体内多数肿瘤蛋白和肿瘤抑制因子在PI3K/AKT信号转导通路中以一种平衡的方式会聚参与细胞代谢和信号调节，但在肿瘤发展中，这种平衡可通过激活和失活机制打破。在多数肿瘤细胞中，吴茱萸碱能够调控PI3K/AKT信号通路诱导肿瘤细胞的凋亡[20-22]，在鼻咽癌中尚无报道。本研究证实吴茱萸碱能够抑制PI3K/AKT信号通路活性，且使用PI3K/AKT信号通路激活剂后，吴茱萸碱抑制PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin蛋白表达的能力被减弱，同时吴茱萸碱抑制鼻咽癌细胞增殖和诱导凋亡的效应受到了抑制。而LY294002组的蛋白表达水平和增殖活性均降低，凋亡率升高，与吴茱萸碱组对细胞的作用趋势一致，提示吴茱萸碱抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖和诱导凋亡的部分机制是通过调控PI3K/AKT信号通路实现的。

综上所述，本研究证实吴茱萸碱能够抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导凋亡，并初步验证了其抗鼻咽癌作用与抑制PI3K/AKT信号通路，进而降低增殖和凋亡相关蛋白PCNA、XIAP、Survivin的表达水平有关。

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〔收稿日期〕2022-11-07

〔基金项目〕国家自然科学基金项目（81973914，81874408）；湖南省教育厅项目（21B0358，21C0241）；湖南省中医药管理局项目（D2022105）；2021年度湖南中医药大学校级科研基金项目（2021XJJJ014，2021XJJJ008）；湖南省卫生健康委员会项目（D202307017740）。

〔第一作者〕郭利培，女，硕士研究生，研究方向：中医药防治耳鼻喉疾病。

〔通信作者〕*何迎春，女，博士，教授，博士研究生导师，E-mail：heyingchun@hnucm.edu.cn；王贤文，男，博士，副主任医师，硕士研究生导师，E-mail：zhuangzhilinyun@163.com。