2015-2019年上海某院致泻性大肠埃希菌流行与耐药特征*

施怡茹,郁 晞,卢晓芸,马树文,龚 羲,徐秋芳

上海市青浦区疾病预防控制中心微生物检验科,上海 201700

致泻性大肠埃希菌(DEC)主要引起人类感染性腹泻和食物中毒,是众多国家和地区夏秋季引起腹泻的主要病原菌之一。既往研究报道伊朗中部和印度北部DEC检出率分别为13.91%、29.00%[1-2];在国内多省市,DEC均为引起感染性腹泻的前3位细菌[3-5]。根据携带的毒力基因、致病机制和流行病学特征,DEC可分为肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠集聚性大肠埃希菌(EAEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌[EHEC或产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)]及弥散黏附性大肠埃希菌(DAEC)[6]。近年来,DEC对青霉素类、头孢菌素类和喹诺酮类等常用抗菌药物出现了较高的耐药率,耐药监测数据显示我国多地区DEC多重耐药(MDR)率为50%以上[7]。为进一步了解上海市青浦区DEC耐药情况,本研究收集青浦区2015-2019年腹泻门诊患者肛拭子标本中分离的DEC,以微量肉汤稀释法测定其最小抑菌浓度(MIC),分析其抗菌药物敏感性,结合人口社会学信息进行统计学分析,为辖区DEC引起感染性腹泻和相关耐药的防控工作提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015-2019年上海市青浦区腹泻病监测定点医院上海复旦大学附属中山医院青浦分院(以下简称本院)腹泻门诊收治的疑似细菌性腹泻初诊患者为研究对象。患者纳入标准:症状以腹泻为主,次数≥3次/天,粪便性状异常,为稀便、水样便、黏液便或脓血便等。

1.2仪器与试剂 Vitek 2 Compact全自动微生物检测系统。Vitek 2 GN生化鉴定板条(法国,BIOMERIEUX);ETEC、EHEC、EIEC、EAEC、DAEC、EPEC核酸检测试剂盒[荧光定量聚合酶链反应(PCR)法,上海之江生物科技股份有限公司];麦康凯琼脂(MAC)平板、O157显色平板、肠道综合发酵管A+B(上海科玛嘉微生物技术有限公司);mEC肉汤(青岛海博生物技术有限公司);Cary-Blairt培养基、革兰阴性需氧菌药物敏感性检测板[型号B-3、B-4,上海复星高科技(集团)有限公司]。所有试剂均在有效期内使用。

1.3方法

1.3.1标本采集 由腹泻门诊按照《上海市腹泻病监测实施方案(2014年试行版)》采集符合要求的腹泻患者肛拭子标本,保存于Cary-Blair培养基,采样后2 h内送检。根据患者采样信息,所有患者口述就诊前未服用抗菌药物。

1.3.2菌株分离鉴定和收集 按照《上海市腹泻病监测实施方案(2014年试行版)》实验室检验部分的标准操作规程,将收到的肛拭子标本划线接种到MAC平板上,36 ℃培养24 h,若分离菌株疑似为EHEC(O157∶H7),用mEC肉汤增菌后,划线接种于O157显色平板上,36 ℃培养24 h;挑取可疑菌落进行初步生化试验,采用荧光定量PCR(循环参数:37 ℃×2 min;94 ℃×2 min;93 ℃×15 s,60 ℃×60 s,循环40次;于60 ℃荧光检测)在Vitek 2 Compact全自动微生物检测系统上进行确证。所有DEC菌株均由上海市疾病预防控制中心病原检定所复核鉴定。收集2015-2019年分离鉴定的DEC菌株,于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.3微量肉汤稀释法检测药物敏感性 采用微量肉汤稀释法,以商品化药物敏感性检测板检测菌株对12类26种常用抗菌药物[氨苄西林(AMP)、氨苄西林-舒巴坦(SAM)、四环氧普林(TET)、氯霉素(CHL)、复方磺胺甲噁唑(SXT)、头孢咪唑(CFZ)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢西丁(CFX)、庆大霉素(GEN)、亚胺培南(IMI)、萘啶酸(NAL)、磺胺异噁唑(Sul)、环丙沙星(CIP)、阿莫西林-克拉维酸(AMC)、多黏菌素E(CT)、多黏菌素B(PB)、米诺环素(MIN)、阿米卡星(AMI)、氨曲南(AZM)、头孢吡肟(FEP)、美罗培南(MEM)、左氧氟沙星(LEV)、多西环素(DOX)、卡那霉素(KAN)、链霉素(STR)]和2种超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)抑制剂[头孢噻肟-克拉维酸(CTX-C)、头孢他啶-克拉维酸(CAZ-C)]的MIC值,按照试剂盒说明书进行试验操作,根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)发布的M100 S31文件中的药物敏感性折点进行结果判定。质控菌株采用大肠埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.4统计学处理 采用Excel 2010软件整理数据,采用SPSS25.0统计软件进行统计分析。计数资料以例数或百分率表示,采用χ2检验或Fisher确切概率法进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1DEC检出情况 2015-2019年共收到本院腹泻门诊送检的肛拭子标本6 772份,其中4 494份符合本研究纳入标准,513份肛拭子标本检出1种DEC分型,标本阳性率和DEC检出率均为11.42%,分别为339株ETEC(66.08%)、97株EPEC(18.91%)、74株EAEC(14.42%)、1株EHEC(0.19%,2017年3月发病、女性、学生)和2株EIEC(0.39%,2015年9月发病、男性、工人)。发病高峰集中于第3季度。阳性患者集中于19～<36岁年龄段,以工人为主。各年度DEC检出率比较,差异有统计学意义(χ2= 24.570,P<0.001)。见表1。

表1 2015-2019年青浦区DEC检出情况[n或n(%)]

年度(年)n季度第1季度第2季度第3季度第4季度毒力分型EAECEHECEIECETECEPEC合计20159780757251120591789(9.10)20161 48011313915270010338168(11.35)201769411397413018318115(16.57)2018592111463130039961(10.30)20197501145781000551580(10.67)合计4 49445839655741233997513(11.42)χ2111.390-24.570P<0.001-<0.001

2.2DEC耐药情况与流行变迁 分离的DEC菌株中,500株完成26种(12类)常用抗菌药物和2种ESBLs抑制剂的药物敏感性试验。2015-2019年DEC至少对1种抗菌药物耐药的耐药率分别为89.89%、83.23%、93.86%、96.72%和90.67%,差异有统计学意义(χ2=12.650,P=0.013),不存在线性相关(P=0.077),线性弥合趋势见图1。

DEC对抗菌药物的耐药率以NAL最高(60.20%),其他依次为AMP(57.80%)、SXT(31.40%)、Sul(30.20%)、TET(27.60%)、CFZ(22.20%),对其余22种抗菌药物的耐药率均未超过20.0%。各种抗菌药物耐药情况逐年变化,其中CTX-C、GEN、STR、TET、SXT、Sul和AMP这7种抗菌药物各年度的耐药率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。各毒力分型DEC对不同抗菌药物的耐药率不同,ETEC对11种抗菌药物的耐药率明显低于EPEC和EAEC,对NAL的耐药率高于EAEC、EPEC,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注:①为至少对1种抗菌药物耐药;②为MDR,即对3类或3类以上抗菌药物耐药。

2.3MDR情况 500株DEC的MDR率为46.40%(232/500),其中EAEC为75.00%(54/72),EPEC为58.95%(56/95),ETEC为36.97%(122/330),差异有统计学意义(χ2=41.446,P<0.001)。2015-2019年MDR率分别为40.45%(36/89)、51.55%(83/161)、40.35%(46/114)、47.54%(29/61)、50.67%(38/75),差异无统计学意义(χ2=5.244,P=0.263),不存在线性相关(P=0.518),线性弥合趋势见图1。

2.4ESBLs检出和碳青霉烯类耐药情况 500株DEC菌株中52株为产ESBLs菌株,检出率为10.40%,其中10株对CTX-C均耐药。2015-2019年DEC菌株中ESBLs检出率分别为12.36%(11/89)、3.11%(5/161)、19.30%(22/114)、11.48%(7/61)、9.33%(7/75),差异有统计学意义(χ2=19.414,P<0.001);EAEC、EPEC和ETEC中的ESBLs检出率分别为6.94%(5/72)、7.37%(7/95)、12.12%(40/330),差异无统计学意义(χ2=2.891,P=0.236)。对检出碳青霉烯类抗菌药物耐药菌株3株,均为EAEC。

2.5人口社会学特征与耐药 不同职业、户籍患者的MDR率、ESBLs检出率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 2015-2019年青浦区DEC的耐药情况(%)

续表2 2015-2019年青浦区DEC的耐药情况(%)

表3 不同人口社会学特征患者分离DEC菌株的MDR和ESBLs检出情况

3 讨 论

DEC的耐药问题日趋严峻,已成为治疗临床感染的严重威胁。既往研究报道伊朗中部地区和越南胡志明市腹泻患者分离的DEC的MDR率分别高达78.13%和71.84%[1,8]。安徽地区、武汉同济医院及上海地区检出DEC的MDR率分别为54.76%、66.67%和65.44%[7,9-10]。

2015-2019 年上海青浦区腹泻病定点监测医院腹泻门诊患者的DEC检出率(11.42%)略高于上海市检出率(5.81%)[4]和全国检出率(7.70%)[11]。阳性患者集中于19～<36岁人群,以工人为主。青浦区DEC检出率略高于上海市检出率,可能与青浦区的外来人口主要以工人为主,而工人的饮食卫生习惯、意识和经济水平相对较低。2017年的DEC检出率明显高于其余4年,可能因为就诊患者中工人占比大,且2017年工人群体中DEC检出率增加从而影响总体检出率。

对碳青霉烯类抗菌药物耐药或产ESBLs的DEC是世界卫生组织首份抗菌药物耐药“重点病原体”清单中一员[12]。2020年全国细菌耐药监测网数据显示,上海地区DEC对碳青霉烯类、第3代头孢菌素类等多种主要抗菌药物耐药率均超过全国平均水平[13],应给予高度重视。

2015-2019年DEC的耐药率总体呈上升趋势,各年度差异有统计学意义(P<0.05),以NAL耐药最为严重,其次为AMP、Sul、SXT等。各抗菌药物中仅CTX-C、GEN、STR、TET、SXT、Sul和AMP这7种抗菌药物在各年度的耐药率比较中差异有统计学意义(P<0.05)。2015-2019年MDR情况严峻,各年度MDR率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。研究结果显示青浦区DEC对CTX耐药率远低于安徽[7]、杭州[3]等地区,但肠杆菌属对第3代头孢菌素和NAL经诱导易产生耐药性[14],其严峻的耐药现状和趋势仍需引起重视。

2015-2019年青浦区腹泻门诊检出产ESBLs菌株52株(10.40%),高于福建省腹泻门诊(4.54%)[15],远低于杭州市腹泻门诊(29.41%)[3]。对碳青霉烯类抗菌药物耐药的菌株3株,均为EAEC,产ESBLs是DEC对第3代头孢菌素类药物耐药的重要机制[16]。需引起医院和耐药防控的重点关注。

各毒力分型DEC对不同抗菌药物产生了不同程度的耐药。ETEC对11种抗菌药物的耐药率明显低于EAEC、EPEC,对NAL的耐药率高于EAEC、EPEC,差异均有统计学意义(P<0.05),与文献[1,3,7-10]报道一致,仅EAEC毒力分型对CAZ耐药。病原菌耐药性主要由抗菌药物失活、药物外排泵、降低对抗菌药物的渗透性和抗菌药物靶点改变这4类耐药机制产生[17],对各种抗菌药物耐药由相应的耐药基因编码,故可考虑不同毒力分型DEC对各种抗菌药物的耐药差异可能与不同分型菌株会携带、介导不同耐药机制的基因或耐药基因有关。

人口社会学特征分析中,MDR率随年龄增长而升高,但差异无统计学意义(P>0.05);不同职业、户籍患者的MDR率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。其中农民MDR率最高(80.00%),经分析农民群体75%为60岁以上人群,除年龄原因外,还可能与其耐药意识和医嘱服从性较差有关;其次为离退休人员(53.66%,高龄人群),符合各研究中年龄越大,MDR越严重的结论[1,3,18]。外来流动人口的MDR率和ESBLs携带率均高于本地常住人口,差异有统计学意义(P<0.05),可能与医疗机构的用药习惯和规范程度有关,或可能与本地常住人口的用药医嘱服从性相对较好有关[19-20]。

本研究分析了上海市青浦区DEC的流行特征和耐药情况,为DEC引起的腹泻疫情防控和临床药物的规范使用提供合理建议和参考,为进一步研究该地区DEC耐药机制提供基础数据。本研究数据仅来源于青浦城区唯一一家三级综合性医院,就诊患者可能相对集中于青浦城区和东片区居民,但该医院为青浦区唯一一家市级腹泻病监测定点医院,服务面覆盖全辖区,能够相对充分地反映辖区的DEC流行和耐药分布情况。《上海市腹泻病监测实施方案(2014年试行)》未要求青浦区腹泻病监测定点医院开展5岁以下儿童腹泻监测,且2015-2019年标本来源患者中仅5例为5岁及以下儿童,故不纳入研究。后期应完善社区肠道门诊监测或增加定点医院,以健全青浦区DEC耐药谱,加强规范用药指导。