黄颡鱼源温和气单胞菌的分离鉴定及中草药体外抑菌效果研究

侯廷龙，刘惠茹，李春涛，王庆容

(1.遵义师范学院生物与农业科技学院，贵州遵义 563000；2.天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300392；3.暨南大学水生生物研究中心，广州 510632)

黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)广泛分布在我国各大干支流及附属水体中，在江河、湖泊、池塘中均有栖息[1，2]。其肉质鲜嫩细腻、味道鲜美，有着较高的营养价值和经济价值，深受消费者的喜爱[3]。近年来，随着养殖集约化程度大幅度提高，出现养殖环境逐步恶化、苗种质量下降、病原耐药性增强等，致使黄颡鱼养殖病害频发，温和气单胞菌是其主要的致病菌[4]。

温和气单胞菌(Aeromonassobria)是弧菌科(Vibrionaceae)气单胞菌属(Aeromonas)的一种重要的条件致病菌，普遍存在于淡水、土壤、淤泥等环境中，在世界各地均有分布[5]。温和气单胞菌是危害我国淡水养殖业的重要病原菌之一，能引发鱼类、爬行类、两栖类等的出血性败血症[6]。据报道，该菌可以感染青鱼(Mylopharyngodonpiceus)、细鳞鱼(Brachymystaxlenok)、南方大口鲶(SilurussoldatovimeridionalisChen)、鲫(Carassiusauratus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)和长丝裂腹鱼(Schizothoraxdolichonema)、中华鳖(TrionyxSinensis)以及大鲵(Andriasdavidianus)等并引起大量死亡[6-10]。该菌也是重要的人畜共患病的病原菌，能引发腹泻、伤口感染和败血症等症状[11]。研究显示，温和气单胞菌其主要致病因子是温和气单胞菌产生的多种溶血素和肠毒素，这些毒素具有多种生物活性，可引起动物体发生复杂的病理变化[12]。

目前，在我国水产养殖鱼类细菌疾病的治疗中，抗生素药物仍为治疗首选，但长期使用易导致耐药性和药物残留问题[13，14]。中草药是天然药物，资源丰富；提取的中草药活性成分属次级代谢物，易降解，可有效避免药物残留，毒副作用少，安全性高，不易引起药源性疾病和产生耐药性，对环境污染少；中草药还有促进生长、调节免疫力和提高机体抗病力等作用[15，16]。已有研究表明，黄芪(Astragalusmembranaceus)、黄连(Coptischinensis)、番石榴(Psidiumguajava)、龙须菜(Gracilarialemaneiformis)、肿柄菊(Tithoniadiversifolia)、蒌叶(PiperbetleL.)等中草药对嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)和哈氏弧菌(Vibrioharveyi)等都有较好的抑菌和杀菌效果[17，18]，中草药代替抗生素是水产病害防治的研究热点，研究中草药对致病菌的作用效果、抑制杀灭机理等对中草药防治水产动物疾病有着极其重要的意义。

本研究患病黄颡鱼脾脏、肝脏等内部器官充血，腹部肿大，并有腹水现象。通过人工感染健康黄颡鱼，证实其致病性，经生理生化实验和16S rDNA基因序列分析鉴定病原菌为温和气单胞菌(Aeromonassobria)。采用乙醇提取法获得了30种中草药提取物，测定了30种中草药提取物对分离菌株的体外抑菌效果，筛选出能有效抑制温和气单胞菌的中草药，为进一步开展黄颡鱼因温和气单胞菌感染的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验用鱼：患病黄颡鱼[体质量(38.3 ± 5.4)g]及健康鱼[体质量(25.7 ± 3.8)g]来自遵义金鼎镇合江源养殖场。

中草药：蛇床子(Cnidiummonnieri)、牡丹皮(Paeoniasuffruticosa)、黄芪(Astragalusmembranaceus)、陈皮(CitrusreticulataBlanco)、藿香(Agastacherugosa)、猪苓(Polyporusumbellatus)、黄柏(PhellodendronchinenseSchneid)、苦参(SophoraflavescensAlt.)、肉桂(CinnamomumcassiaPresl)、烟叶(NicotianatabacumL.)、乌梅(DarkPlumFruit)、樟叶(C.glanduliferum)、夹竹桃(NeriumoleanderL.)、诃子(TerminaliachebulaRetz.)、黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、黄连(CoptischinensisFranch.)、大黄(RheumpalmatumL.)、桑白皮(MorusalbaL.)、石榴皮(PunicagranatumL.)、大青叶(IsatisindigoticaFortune)、蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)、鸡血藤(SpatholobussuberectusDun)、虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt.)、龙胆草(Adenophoracapillaris)、青蒿(ArtemisiacarvifoliaBuch.)、金银花(LonicerajaponicaThunb.)、败酱草(SonchusarvensisL.)、地榆(SanguisorbaofficinalisL.)、杜仲(EucommiaulmoidesOliver)、板蓝根(IsatisindigoticaFort.)、厚朴(Houpoeaofficinalis)、穿心莲(Andrographispaniculata)30种中草药购自遵义市百姓大药房。

中草药提取液制备：将30种中草药烘干并用粉碎机粉碎经0.3 mm过滤网后各称取20 g，再加入500 mL 95%的乙醇浸泡24 h后，在旋转蒸发仪中进行提取，重复2次；所得浸膏置于55 ℃烘箱中干燥至恒重。称取2 g浸膏配成2 000 mg/mL的药物原液，储存于4℃冰箱备用。

细菌培养基：液体培养基为蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL，pH调至7.0～7.2。固体培养基为每1 000 mL液体培养基加入18 g琼脂。

1.2 病原菌初步分离纯化

无菌条件下，取患病黄颡鱼肝、脾、肾的组织直接接种于固体培养基平板，37℃培养10～16 h，挑取形态、大小一致的单个优势菌落，纯化2次获得纯培养，接种液体培养基培养16 h，-80 ℃保存备用。

1.3 人工感染试验

将分离得到的菌株接种到固体培养基平板，37 ℃恒温培养16 h，挑取单一菌落接种于500 mL液体培养基中，37 ℃恒温摇床培养12 h。用无菌生理盐水配制细菌密度分别为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104cfu/mL。然后把健康的黄颡鱼按照每尾0.2 mL的不同密度的菌液腹腔注射进行人工感染，对照组鱼注射0.2 mL 0.65%的无菌生理盐水，每一组均注射20尾鱼，每组三个平行。每天投喂以及充气换水，攻毒后每日观察试验鱼的发病死亡情况，出现与自然发病鱼症状一致，对死亡鱼及时进行剖检和细菌的再次分离。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 生理生化特征检测

观察分离菌的菌落形态，革兰氏染色观察细菌形态。挑取单个菌落接种于试管中，37 ℃培养，并按照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行初步鉴定。

1.4.2 病原菌16S rDNA基因序列测定及系统发育分析

使用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA。用16S rDNA的通用引物，上游引物：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物；5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。PCR产物经过电泳检测条带大小正常然后导入到pMD18-T载体并转化到DH5α之中，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。把测序得到的16S rDNA序列放入NCBI数据库进行比对，用DNA star和MEGA5.0软件构建系统进化树。

1.5 抑菌作用的测定

用移液器吸100 μL温和气单胞菌的菌悬液分别均匀涂布在直径9 cm的普通营养琼脂平板上，晾干后用直径6 mm的打孔器在每个固体培养基平板上均匀打4个孔。向孔中滴加供试中草药原液，每孔30 μL，用封口膜封口后置于37 ℃恒温培养箱中培养，培养24 h后观察并用游标卡尺测量抑菌圈的直径大小。

1.6 最小抑菌浓度(MIC)测定

根据抑菌作用的测定结果，选取有效抑菌的中草药，采用对倍稀释法测定抑菌浓度。取15支试管分别加入1 000 μL液体培养基，向1号试管加入1 000 μL药液，采用倍比稀释后使药液终浓度分别为1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24 mg/mL，各试管中分别加入100 μL的菌液，14号试管是加入等量培养基和菌液但不加药液的阳性对照组，15号试管加入等量培养基不加菌液作为阴性对照，最后混匀后置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，无菌生长试管中的最低药物浓度即为MIC。

1.7 最小杀菌浓度(MBC)测定

吸取各药物的MIC和高于MIC浓度的各个梯度培养混合液100 μL，涂布于固体培养基平板上，37 ℃培养24 h后观察有无菌落形成，无菌落形成所对应试管中的最低药物浓度即为最小杀菌浓度。

2 结果

2.1 生化鉴定结果

对病原菌MLT-1进行生理生化特征分析，菌落形状圆形、表面光滑、边缘整齐、略凸起，经革兰氏染色镜检为阴性短杆状(图1)；产生吲哚；赖氨酸脱羧酶阳性；利用山梨醇；不利用柠檬酸盐；D-葡萄糖不能产气(表1)。病原菌MLT-1与标准菌株温和气单胞菌生理生化特性基本一致，初步判定为温和气单胞菌。

表1 分离菌株MLT-1的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the isolated strain MLT-1

图1 MLT-1菌株的菌落形态(a)及菌体革兰氏染色(b)Fig.1 Colony(a)and gram staining(b)of MLT-1 strain

2.2 16S rDNA结果和系统发育分析

PCR扩增出16S rDNA片段产物，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示该片段大小约为1 500 bp(图2a)。扩增产物经克隆后测序，其大小为1 530 bp。将序列与GenBank数据库比对，发现与温和气单胞菌的16S rDNA相似度高达100%。系统进化树分析也表明MLT-1与温和气单胞菌聚为一支(图2b)。

图2 MLT-1菌株16S rDNA PCR电泳图片(a)及系统发育树分析(b)Fig.2 The electrophoresis picture of 16s rDNA(a)and analysis of phylogenetictree(b)of MLT-1 strain

2.3 人工感染试验

从病鱼脾脏内分离得到一株优势菌，命名为MLT-1，回归感染健康黄颡鱼结果见表2，1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104cfu/mL组的14 d累计死亡率分别是100%、100%、90%、75%、65%、25%、0%。人工感染鱼病症与自然感染鱼病症一致(图1a)。

表2 MLT-1菌株的动物致病性试验结果Tab.2 Pathogenicity test result of MLT-1 strain

2.4 中草药提取物抑菌结果

测定的30种中草药提取物抑菌效果见表3。结果显示对温和气单胞菌MLT-1效果较好的中草药物是诃子、大黄、烟叶、樟叶、桑白皮。

表3 30种中草药对温和气单胞菌MLT-1的抑菌效果Tab.3 Antibacterial effects of 30 Chinese herbal medicines against A.sobria MLT-1

2.5 最低抑菌浓度和最小杀菌浓度

选取抑菌效果较好的5种中草药醇提物，用二倍梯度稀释方法对温和气单胞菌MLT-1测定MIC和MBC，结果如表4所示。诃子抑杀温和气单胞菌的效果最好，MIC和MBC均为0.49 mg/mL；大黄抑杀温和气单胞菌的效果次于诃子，其MIC为0.49 mg/mL，MBC为0.49 mg/mL；烟叶抑杀效果次于大黄，其MIC和MBC均为0.98 mg/mL；樟叶和桑白皮抑杀次于诃子、大黄、烟叶，其MIC均为1.95 mg/mL，MBC为3.91 mg/mL。

表4 5种中草药醇提物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)Tab.4 MIC and MBC of 5 Chinese herbal medicines against A.sobria mg/mL

3 讨论

本研究采集的黄颡鱼病鱼主要症状是身体鳍条充血、有腹水、反应迟钝、游动缓慢等。类似的症状在自然感染温和气单胞菌的青鱼(Mylopharyngodonpiceus)[9]、大鲵(Andriasdavidianus)[19]、长丝裂腹鱼(Schizothoraxdolichonema)中也有发现[20]，表明温和气单胞菌在感染的不同物种中表现出了相似的病症。

本研究从实验结果中筛选出对病原菌有显著抑杀效果的中草药诃子MBC为0.49 mg/mL、大黄MBC为0.49 mg/mL、烟叶MBC为0.98 mg/mL、樟叶MBC为3.91 mg/mL、桑白皮MBC为3.91 mg/mL。刘腾飞等[21]报道诃子水提物浓度0.625 mg/mL时在体外具有很强的抗淋球菌的作用。喻运珍等[22]报道诃子浓度0.12 mg/mL对嗜水气单胞菌有较强抑菌作用。以上研究表明同一中草药对不同菌的抑菌效果也存在着较大的差异，可能是药物的成分对不同菌作用机理不同所致。石洪玥等[23]研究了黄芩水提物浓度6.25 mg/mL对嗜水气单胞菌有抑菌效果。张海宾等[24]用大黄浓度50 μg/mL对嗜水气单胞菌进行实验，发现有较大的抑菌圈。上述研究中不同中草药对同一细菌的杀菌效果有明显差异，其原因主要可能是因为不同中草药所含的有效成分不同所致。

不同研究者使用同种中草药对温和气单胞菌进行试验，其结果也有差异。白富瑾等[19，25]用诃子分别测得MIC为15.6 mg/mL、25.0 mg/mL，而本研究为0.49 mg/mL。何爱华等[26，27]用大黄分别测得MIC为8 mg/mL、0.49 mg/mL，本研究为0.49 mg/mL。上述已有的研究结果与本实验测得结果也存在一定差异。存在这样的差异可能是由于提取方式的不同，本研究主要是乙醇提取物，而其他研究者是水提物，对中草药的有效成分采取不同的提取工艺，引起药效存在明显的差别。提取过程中温度过高，也会导致药液中有效成分失活。中草药所含的活性成分同样受生长环境地区的不同、季节的不同、植物部位的不同从而影响药效作用。同种中草药对不同菌株的抑制效果也不同，表明不同菌株之间也存在较大差异。

本研究表明诃子、大黄、桑白皮、香樟、烟草对温和气单胞菌有较好的抑菌作用。其抑菌作用可能与中草药中的某些化学物质有关。孟祥锋[28]的研究表明诃子的抑菌活性成分为鞣质类物质，主要是没食子酸及诃子酸等。大黄提取物对嗜水气单胞菌的抑菌活性随着蒽醌含量的增加而提高[29]。桑白皮中的酚类化合物具有抗金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌活性[30]。桑白皮中的桑辛素可以通过破坏细胞膜结构和抑制金黄色葡萄球菌的磷脂酸生物合成途径而发挥抗菌作用[31]。香樟精油和樟脑可使睡茄软腐病菌菌丝溶解和细胞质凝固，从而可以有效的抑制该致病菌的生长[32]。烟草中烟碱浓度达10 mmol/L时大肠杆菌的生长受到完全抑制[33]。上述的研究表明不同中草药发挥作用的抑菌成分不同，而在本研究中这些中草药对于同一株病原菌都有较好的抑菌效果，可能表明这些活性成分具有破坏细胞的作用。中草药植物含有抗菌活性成分复杂，不同的化学成分抑菌机理也是各不相同。目前报道的关于中草药抑菌的作用机理主要是破坏细胞膜的渗透压，使机体内的酶类和代谢产物溢出导致死亡；抑制病原菌的酶系统活性，破环其新陈代谢；抑制生物大分子的合成等[34]。

中草药具有绿色环保、易降解、不残留等优点，可以被开发为绿色生态渔药，具有较好的应用前景。本文通过30种中草药的体外抑菌试验，探究了抑制温和气单胞菌的不同中草药效果，为筛选出有效抑制鱼类温和气单胞菌感染的中草药提供了重要的参考资料。