三种投入品对克氏原螯虾抗氧化酶、丙二醛、磷酸酶和溶菌酶的影响

王 宁，郑 尧，，刘祝萍，张凤翔，孔繁彬，孟顺龙，陈家长，

(1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214128；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部稻渔综合种养生态重点实验室，江苏无锡 214081；3.兴化市现代农业发展服务中心，江苏兴化 225700；4.兴化市香湖粮食种植家庭农场，江苏兴化 225700)

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)又名小龙虾，也称为红螯虾和淡水小龙虾，是我国重要的淡水经济虾类，其风味独特，肉质鲜美且营养价值高[1]，随着其种群的扩展和养殖活动的增加，在长江中、下游地区，已形成可供利用的庞大种群[2]。在克氏原螯虾养殖过程中，养殖户常使用硫酸铜和青苔净杀灭因投料过多以及使用水质改良剂产生的蓝藻及青苔。在其他水产品养殖过程中硫酸铜应用也比较广泛，但存在过量使用的情况，且面源残留的铜离子也会流入养殖水体，造成铜离子超标[3]。兴化虾蟹混养模式在江苏等省份广泛推广，该模式主要特点是收集和定量放养抱仔虾[4]，期间养殖户为了管理方便，常使用草甘膦去除塘边杂草，部分草甘膦便随地表径流流入池塘导致克氏原螯虾面临染毒风险。

肝胰腺是甲壳动物消化、吸收、储存和代谢功能的重要器官[5]，环境胁迫会导致肝胰腺中抗氧化酶活力和其他相关酶活力的变化，研究表明铜离子对鲤(Cyprinuscarpio)[3]、麦穗鱼(Pseudorasboraparva)[6]、银鲑(Oncorhynchuskisutch)[7]、泥鱼(Labeocapensis)和大口黑鲈(Micropterussalmoides)[8]等鱼类造成肝胰脏急性毒性，青苔净进入动物体后会引起继发性溶血反应[9]，草甘膦对水生动物也具有一定的毒性[10，11]，但实验中的投入品浓度是否会影响克氏原螯虾肝胰脏毒性不得而知。本研究旨在探究三种常用投入品对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化酶、丙二醛、磷酸酶和溶菌酶活性的影响，为克氏原螯虾健康养殖提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设计

实验虾体长(81.69±3.65)mm，体质量(21.31±2.07)g，取自兴化市香湖粮食种植家庭农场，实验室中暂养7 d后，挑选体格健壮、健康的克氏原螯虾置于玻璃缸(63 cm×43 cm×45 cm)中，注入15 L曝气自来水，暂养以及实验过程中水温控制在(18.5±2.3)℃，pH为7.5±0.6，溶解氧为(8.6±2.9)mg/L，正常投饵，每日光暗比12 h ∶12 h。

硫酸铜(优级纯)购自国药集团，青苔净[主要成分二甲戊乐灵(Pendimethalin)含量40%]购自中水渔药有限公司，草甘膦(有效成分草甘膦含量为30%，草甘膦异丙胺盐含量41%)购自澳大利亚拜迪斯有限公司。

参考实际生产中使用浓度设置对照、CuSO4(1和2 mg/L，分别记为CuⅠ、CuⅡ组)、青苔净(5和10 μg/L，分别记为PⅠ、PⅡ组)、草甘膦(5 μg/L和10 μg/L，分别记为GⅠ、GⅡ组)，每组设置三个平行，每个平行10只个体。实验期间正常投饵，采用半静水式养殖方法，不间断微量充氧，暴露期间每24 h换水1/3并补足药物，分别于第4、8和12 d于冰上采集克氏原螯虾的肝胰腺，取出后放置于-80 ℃冰箱备用。

1.2 酶活性测定方法

准确称取待测组织的质量，按质量(g)∶体积(mL)=1 ∶9的比例加入9倍体积的生理盐水，用电动研磨器充分研磨后，在冷冻离心机(2 500 r/min，4 ℃)离心10 min，取上清液(10%组织匀浆液)，放入2 mL离心管中，待测。

蛋白定量(TP)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、还原型谷胱甘肽(GSH)、总抗氧化能力(T-AOC))、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所,测定步骤按试剂盒进行。其中,TP、SOD、CAT、MDA的测定分别采用托马斯亮蓝法、WST-1法测定、钼酸盐法、TBA法。

1.3 统计分析

用Microsoft Excel 2019进行数据统计与分析，采用SPSS 26.0进行统计描述，多个样本均数采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，以Duncan法进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义，绘图采用OriginPro 2018。

2 结果与分析

2.1 三种投入品对克氏原螯虾抗氧化酶活性的影响

在整个实验暴露期间，6个实验组的SOD、CAT和GPX活性均表现出先升高后降低的变化趋势(图1a，图1b，图1f)，8 d时实验组显著高于对照组。CuⅠ实验组GR活性表现出持续升高的变化趋势(图1c)，8 d时实验组显著高于对照组，而其他实验组则表现出先上升后降低的变化趋势(图1)。6个实验组的GSH活性表现出先升高后降低的变化趋势(图1d)，4 d时实验组显著低于对照组。6个实验组的T-AOC活性表现出持续降低的变化趋势(图1e)，4 d时实验组显著高于对照组。8 d时实验组的SOD、CAT、GR和GPX活性均显著高于对照组且实验组的SOD、CAT、GSH和GPX活性在8 d时达到最大值；T-AOC活性在4 d时达到最大值，随后逐渐降低。

图1 三种投入品对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化酶活性的影响Fig.1 Effects of three inputs on the activity of antioxidant enzymes in the hepatopancreas of P.clarkii处理组与对照组之间存在显著差异用不同小写字母表示(P<0.05)，下同。

2.2 三种投入品对克氏原螯虾MDA含量的影响

整个实验暴露期间，CuⅠ、CuⅡ、PⅠ、PⅡ、GⅡ组MDA含量表现出先降低后升高的变化趋势(图2)，GⅠ实验组MDA含量表现出持续升高的变化趋势(图2)，12 d时，实验组MDA含量显著高于对照组，青苔净和草甘膦暴露下MDA含量在12 d时达到最大。

图2 三种投入品对克氏原螯虾肝胰腺MDA含量的影响Fig.2 Effects of three inputs on MDA content in P.clarkii hepatopancreas

2.3 三种投入品对克氏原螯虾ACP和AKP活性的影响

整个实验暴露期间，CuⅠ、PⅠ、GⅠ、GⅡ实验组ACP活性表现出先降低后升高的变化趋势(图3a)，CuⅡ、PⅡ实验组ACP活性表现出持续上升的变化趋势(图3a)。 CuⅠ、CuⅡ、PⅠ、PⅡ浓度组AKP活性表现出先下降后上升的变化趋势(图3b)，GⅠ、GⅡ浓度组AKP活性表现出持续上升的变化趋势(图3b)，6个实验组12 d时ACP活性达到最大值。

图3 三种投入品对克氏原螯虾肝胰腺磷酸酶(ACP和AKP)活性的影响Fig.3 Effects of three inputs on the activity of hepatopancreatic phosphatase(ACP and AKP)in P.clarkii

2.4 三种投入品对克氏原螯虾LZM活性的影响

整个实验暴露期间，CuⅠ、CuⅡ、GⅠ、GⅡ实验组LZM活力表现出先上升后下降的变化趋势(图4)，PⅠ、PⅡ实验组LZM活力表现出持续下降的变化趋势，8 d时，实验组LZM活性均高于对照组。

图4 三种投入品对克氏原螯虾肝胰腺LZM活性的影响Fig.4 Effects of three inputs on LZM activity of P.clarkii hepatopancreas

3 讨论

3.1 三种投入品对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化酶活性的影响

T-AOC的大小反映了机体抗氧化酶系统和非酶系统对外来刺激的代偿能力以及自由基的代谢状态[22]，可以反映机体的抗氧化能力。本研究结果也表明，当机体内与抗氧化相关的酶活性升高时，T-AOC的活性也出现了提升。投入品长时间作用下会引起机体的代偿失调、抗氧化酶系统遭到破坏[23]，进而导致机体损伤。本研究表明，克氏原螯虾在本实验浓度投入品毒性下抗氧化酶类活性受到影响，12 d时抗氧化相关酶均有不同程度的降低，但若长时间处于相应环境下，可能因超过自由基清除能力进而对抗氧化酶系统造成损伤。

3.2 三种投入品对克氏原螯虾肝胰腺MDA含量的影响

脂质过氧化之后的主要产物是MDA，MDA含量可直接反映生物体内脂质过氧化的强弱[24]，间接反映氧化损伤的程度，MDA能降低细胞膜的通透性与流动性[25]，其含量随机体的氧化应激水平的升高而增加[26]，且含量越高表明机体遭受损伤的程度越大。含污染物化工区溪流水体中斑马鱼肝脏MDA含量随着暴露时间的延长表现出先下降后上升的变化趋势[27]，实验中4～8 d时，Cu Ⅰ、Cu Ⅱ、P Ⅰ、P Ⅱ、G Ⅱ处理组CAT活性处于升高趋势，MDA含量出现降低，这是由于CAT可以抑制MDA的生成；8～12 d，CAT活性降低，此时实验中各浓度组MDA含量表现出上升趋势，并在12 d时除CuⅡ浓度组外均达到最大值，宋玥颐[15]也发现0.1、0.5和1 mg/L氟苯虫酰胺处理斑马鱼14 d后，斑马鱼肝脏MDA含量显著增加，这与本实验吻合。

3.3 三种投入品对克氏原螯虾肝胰腺磷酸酶(ACP、AKP)和LZM活性的影响

ACP、AKP和LZM是参与生物体生长代谢、保持内环境稳定及维持机体健康所必需的酶，对生物体的免疫作用具有重要意义。王丽梅等[28]发现0.83、4.15和20.77 mg/L环氧丙烷处理刺参(Stichopusjaponicus)48和72 h后其体腔液AKP、ACP活性增强，彭军辉等[29]证实拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)体内ACP和AKP活性随氨氮胁迫时间的增加而升高，沈敏等[30]发现高盐胁迫下凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)体内ACP活性升高，酸性磷酸酶(ACP)是溶酶体的一种标志酶，主要参与细胞内蛋白质的消化和吸收。其中ACP会在生物体血淋巴免疫反应中被释放，对入侵物质进行吞噬和包围[31]，AKP参与生物体营养物质如脂质、糖类、钙和无机磷酸盐的吸收[32]，AKP能提高生物对体内物质的摄取转运和清除异物能力[33]。实验中ACP和AKP活性总体上表现为上升趋势，表明外来物质增多或机体内物质的降解速度升高，需要ACP和AKP活性的增高来应对这种变化。溶菌酶来自单核细胞、中性粒细胞，是一种具有抗菌能力的水解酶，能使细菌破裂，可以在一定程度上反映鱼类非特异性体液免疫状态，是非常重要的非特异性免疫评价指标之一。张瑞标等[34]发现在饲料中添加沼泽红假单胞菌后，皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)LZM活性呈现先升高后降低的趋势，这与本实验CuⅠ、CuⅡ、GⅠ、GⅡ浓度组的变化趋势是一致的，LZM活力下降可能是长时间的投入品胁迫导致克氏原螯虾肝胰腺内生理紊乱，导致其免疫功能降低，从而LZM活力下降。

4 结论

(1)三种投入品扰乱克氏原螯虾肝胰腺抗氧化酶系统，造成脂质过氧化水平升高。

(2)克氏原螯虾肝胰腺SOD、CAT、GPX、GSH活性先被诱导后抑制减弱，处理后期ACP和AKP活性均被诱导；青苔净和草甘膦暴露下GR活性先被诱导后抑制减弱；MDA含量显著增加；硫酸铜和草甘膦暴露下，LZM活性先被诱导后抑制减弱。