低温胁迫对秋石斛‘三亚阳光’成苗生理特性的影响

莫顺金　何嘉琦　陆顺教　张志群　尹俊梅　徐诗涛

关键词：秋石斛；成苗；低温胁迫；生理特性；耐寒性

中圖分类号：S682.31 文献标识码：A

秋石斛（Dendrobium spp.）别名蝴蝶石斛，是兰科石斛属多年生草本植物，其花色艳丽丰富，且花期较长，深受大众喜爱。秋石斛是重要的切花材料和盆花种类，是许多国家和地区花卉产业的重要组成部分，如澳大利亚、泰国、新加坡等。据统计，我国花卉行业的市场规模在2018 年已达1562 亿元，2019 年达1656 亿元[1]。我国花卉市场形式逐渐改变，正在形成“西南地区的鲜切花，东南地区的苗木和盆栽，西北寒冷地区的种球，东北地区的花卉加工业”等四大生产布局[2]。在此环境下，大力发展秋石斛花卉产业对地方经济、农民就业等有着至关重要的意义。

温度在植物生长过程中是一个十分重要的影响因子，不同的生育期对温度的要求都不一样[3]。例如温度过高或过低都会使蝴蝶兰难以抽出花梗[4]，持续足够的低温条件才能让春石斛完成花芽分化[5]，当气温每升高1℃时，兰科植物的结实物候期提前2.6 d[6]，由此可见适宜的温度对植株生长发育十分重要。秋石斛原产于热带及亚热带的一些岛屿和国家，是典型的热带兰，因此对生长环境有着十分严格的要求，在气温为25～30℃，湿度为60%～70%的环境中才能正常生长和开花[7]。

其独特的生长条件使得我国仅有少部分地区能进行生产，海南是全国唯一全部位于热带地区的省份，地处热带北缘，也是目前我国秋石斛的主要产地。但即使在海南，冬季秋石斛栽培仍会受到低温的影响，例如在2016 年的低温气候就导致海南省东方市多个秋石斛品种受到低温损伤，甚至无法正常越冬[8]。随着全球环境气候的变化，秋石斛更加容易遭受低温逆境胁迫。2021 年1 月海南省多地气温创多年来1 月上旬新低，全岛平均气温降幅达7～11℃，部分乡镇最低气温降至5℃以下，严重影响了秋石斛的冬季供花。且兰花暴露在寒冷下，植株外部形态会明显发生变化，叶片变黄，植株倒伏等大大影响了兰花的观赏性，对产业发展十分不利。我国引入秋石斛的时间较晚，对其基础研究仍较少，目前针对秋石斛的研究主要集中在栽培管理[9-10]、花色[11-12]及组织培养[13-14]等方面。在耐寒性方面研究相对欠缺，文献报道较少，因此，本研究以市场上广泛栽培品种‘三亚阳光成苗为试验材料，通过测定不同低温条件下叶片生理指标变化规律，探索其对不同程度低温耐受时间，以期为‘三亚阳光成苗生产中应对低温逆境问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以栽植于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带兰花资源圃内的秋石斛‘三亚阳光成苗为试验材料，挑选生长健壮，状态良好，长势相对一致的植株，株高约35～40 cm，苗龄为15 个月。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 将植株放在温度梯度分别为15、10、5℃的人工气候培养箱中，光暗比14 h/10 h，光强为20 000 lx，相对湿度为85%，在此环境下分别设置0（CK）、1、2、4、8 h 和 1、2、4、8、16 d 的低温处理时间，每个处理20 株，设5 次生物学重复。处理结束后，将植株放回苗圃内恢复生长，观察记录落叶情况，并统计落叶率，同时观察开花情况。

1.2.2 样品采集 各低温处理结束后的植株随机采集5 株顶端的全展叶片，用超纯水将叶片表明擦拭干净，后剪碎叶片混匀，用于各项生理指标的测定。测定相对电导率的植株设置同样的栽培环境，温度梯度为 10、5、0、–5℃，分别低温处理12 h，同样随机取5 株顶端的全展叶片用于电导率测定。每个处理重复5 次，取平均值。

1.2.3 测定方法 可溶性蛋白、游离脯氨酸、丙二醛、叶绿素及可溶性糖含量的测定方法分别参照李合生[15]的考马斯亮蓝法、磺基水杨酸比色法、硫代巴比妥酸法、95%乙醇浸提法、蒽酮比色法进行测定。

1.3 数据处理

实验数据为5 次重复，利用Excel、SPSS、Origin 等软件进行数据统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对秋石斛成苗生理指标的影响

2.1.1 可溶性蛋白含量 可溶性蛋白是植物体内一种重要的调节物质，能在植物感受到低温时起到一定的保护作用。由图1A 可以看出，在不同低温处理下，秋石斛‘三亚阳光的成苗叶片中可溶性蛋白含量呈现出一定规律，整体规律为降低–上升–降低–上升。在低温前期处理条件下，可溶性蛋白含量的下降可能是由于秋石斛对低温产生的应激反应，到1 h 后又全部上升。15℃和5℃处理的叶片在2 h 又下降，到1 d 时下降至最低点。而10℃处理则从1 h 上升至4 h 后又显著下降，到2 d 时下降至最低点，然后从最低点持续上升直至最高点，而15℃和5℃处理从1 d 上升至4 d后又下降，到第8 天时才显著上升。

2.1.2 可溶性糖含量 低温会影响植物水分的吸收，可溶性糖是新陈代谢的主要原料，可溶性糖含量的增多能提高细胞渗透浓度，增强保水能力，是一个重要的抗寒性指标。在10℃与15℃低温胁迫下，秋石斛‘三亚阳光成苗叶片中可溶性糖含量变化差异并不明显（图1B），与可溶性蛋白量变化类似，刚开始略微下降，且变化趋势一致，后又呈现上升，下降，上升的变化规律。但是5℃处理时含量变化呈现较大差异，在处理1 h 时就上升至最高值，可能是由于5℃低温胁迫程度较大导致可溶性糖含量大幅度增长来避免较低温度带来的伤害，上升至1 h 含量又显著下降至4 h，之后又上升，到第8 小时持续下降，直至第8 天到达最低点后又迅速上升，变化幅度较大，与另外2 种温度处理的可溶性糖含量变化不太一致。

2.1.3 游离脯氨酸含量 由图 1C 可以看出15℃处理时，游离脯氨酸含量一直处于上升状态，但幅度较小，5℃与10℃处理时波动上升，但增加趋势较大，而5℃处理的游离脯氨酸含量在第8天上升至峰值后，随着处理天数的增加，游离脯氨酸含量不升反降，有可能是此温度太低，在这种强度温度下，秋石斛成苗的自身保护系统受到了破坏，造成了生理损伤，导致合成的游离脯氨酸含量下降。到16 h 时3 种温度处理的秋石斛‘三亚阳光成苗叶片游离脯氨酸含量都显著比对照高，其中10℃时含量最高。游离脯氨酸是一种广泛存在于植物体内的蛋白质组分，本研究中游离脯氨酸含量变化和MDA 含量变化类似，在3 种低温处理下整体呈相近的上升趋势，表明这2 类物质含量在低温胁迫下敏感程度类似。

2.1.4 MDA 含量 丙二醛（MDA）是脂膜过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。从图1D 中可以看出，秋石斛‘三亚阳光成苗叶片MDA 含量在3 种低温处理下整体呈上升趋势，其中5℃处理时除了从第2 小时至第4 小时有小幅度下降外，整体含量增长十分明显，表明植株在处理过程中持续受低温伤害。15℃处理在开始持续上升，从4 h 到2 d 时间范围内含量不断波动，2 d 后又持续上升到达最高点，表明植株在刚开始受到低温胁迫时受到伤害后，一段时间后出现了一定适应性，但是2 d 后MDA含量不断增多，表明随着处理时间越久植株受到的伤害加剧。10℃处理时开始小幅度下降，4 h时持续上升至第4 天，之后又下降至第8 天才上升至最高值。3 种温度处理的MDA 含量均在第16 天时到达最高值，且含量相近，说明低温胁迫随着处理时间的延长加剧了MDA 含量的积累。

2.1.5 叶绿素含量 叶绿素是植物光合作用必不可少的一种色素，叶绿体对低温较为敏感，低温胁迫会对叶绿体内造成伤害，破坏叶绿素结构，使得相关合成酶活性降低导致叶绿素合成速率降低，而且分解速度加快，进而减少叶绿素积累[16]。从图 1E 中可以看出，秋石斛‘三亚阳光成苗叶片的叶绿素含量15℃处理时先小幅度上升至1 h，之后总体呈现下降的趋势。10℃处理时先略微下降，而后呈现上升又下降的规律，大体也呈降低趋势，5℃处理同样呈上升-下降-上升趋势，直至处理1 d 时，叶绿素含量大幅度下降。第16 天时，3 种低温处理的叶绿素含量都到达了最低值，其中15℃和10℃处理呈一定波动性，虽有下降趋势，但下降不明显，5℃处理的下降幅度最大，可见秋石斛对5℃冷胁迫的抵御能力较弱。

2.1.6 相对电导率及半致死温度 随着处理温度的降低，秋石斛‘三亚阳光成苗叶片的相对电导率逐渐升高，在15、10、5、0℃时电导率分别为26.9%、30.8%、56.6%、72.8%，在–5℃时达到96.0%，表明叶片的细胞膜受伤害程度不断增大，植物状态逐渐变差。–5℃时电导率大幅度上升，接近100%，表明叶片细胞膜遭受到了严重伤害，此时植株已基本死亡。根据不同温度处理下的相对电导率，拟合Logistic 方程，求得‘三亚阳光成苗的半致死温度（LT50）为6.1℃。LT50 可代表植物在低温环境下细胞膜系统保持稳定性和完整性的能力，所以LT50 的高低也反映了植物抗寒能力的强弱[17-18]。

2.2 低温胁迫下对秋石斛成苗落叶的影响

叶片是植物光合作用的主要器官，生长状况的好坏会直接影响光合效率与光合产物的积累，在植物感受到低温胁迫时，叶片不仅生理状况会改变，外部形态也会发生明显的变化，秋石斛在低温胁迫后部分叶片变黄及脱落，因此以胁迫后植株的落叶率来判断其抗寒性是比较直观的方法。从图1F 可以看出15℃条件下，秋石斛‘三亚阳光成苗的落叶率变化不明显，比较稳定，在处理第8 天时落叶率到达最高，但低于20%，从图2 也可以明显看出，15℃处理后的植株叶子仍然挺立。10℃和5℃条件下落叶率随着处理时间的延长整体呈明显上升趋势，在处理8 h 以前，落叶率较低并且处于波动状态，均低于20%，落叶并不多，但从8 h 后落叶率开始上升，处理2 d的落叶率开始骤升，落叶开始增多，10℃和5℃处理的落叶率都在第16 天到达最高值，16 d 时10℃处理落叶率达95.92%，叶片几乎落光，5℃处理落叶率高达100%，叶子全部落光。表明秋石斛‘三亚阳光成苗在5℃低温下可以耐受8 d，10℃条件下最少可以耐受16 d。从图2～4 中也可以看出，低温对秋石斛‘三亚阳光成苗的开花也有影响，15℃处理条件下，实验材料的开花和花苞并没有受到多大影响，处理后正常开花，10℃和5℃处理下，随着处理时间延长，从处理第4 天开始，花朵明显受到低温胁迫影响而凋落。

2.3 低温胁迫下秋石斛成苗叶片各生理指标及落叶率的相关性分析

通过对较低温度（5℃ ）和较长胁迫时间（16 d）处理下的秋石斛‘三亚阳光成苗的各项生理指标进行相关性分析（表1）發现，经5℃处理后，LT50 与游离脯氨酸、MDA 含量、落叶率均有极显著的正相关，LT50 与叶绿素含量呈显著负相关；可溶性蛋白含量与叶绿素含量呈显著负相关；可溶性糖含量与游离脯氨酸含量呈显著正相关；叶绿素含量与可溶性蛋白、游离脯氨酸、MDA 含量、落叶率呈显著或极显著的负相关；游离脯氨酸含量和MDA 含量呈极显著正相关，与落叶率呈极显著负相关。

3 讨论

植物抗寒性受多个方面因素的影响，其耐寒机制是一个较为复杂的过程，目前评价植物抗寒性的指标包括生理生化指标、形态指标、基因、蛋白等。在正常生长时，植株体内的各种生理指标都是稳定而协调的，当植株感受到逆境时，体内的生理指标都相应地发生变化来应对逆境[19]。目前的研究发现，与植物抗寒性密切相关的生理指标有相对电导率、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、游离脯氨酸、叶绿素含量等。

细胞膜是植物与外界环境交换信息的重要受体，在低温逆境时细胞膜的生理变化反映了膜系统稳定性，也反映了抗性的强弱，植物受到低温胁迫会导致膜透性改变，破坏膜的完整性，造成胞内离子外渗，引起电导率升高，丙二醛是膜脂过氧化作用相关的产物，因此相对电导率和丙二醛含量常作为耐寒指标[20-21]。本研究中，秋石斛‘三亚阳光成苗叶片的电导率随着处理温度降低而不断上升，表明随着温度的降低，细胞膜透性不断下降，秋石斛受胁迫更加严重，这个结果与许多植物的研究结果一致，如蓝花楹[22]、文心兰[23]、微型月季[24]、黄金菊[25]等。丙二醛的含量也是随着胁迫温度的降低和处理时间的延长呈上升趋势，说明质膜受损加剧，与油茶[26]、茶树[27]、豆梨[28]等结果一致。低温胁迫下植物可以通过积累脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等渗透调节物质降低细胞渗透势，提高植物对逆境的适应性[29]。本研究发现秋石斛‘三亚阳光成苗叶片游离脯氨酸的含量与丙二醛，电导率类似，呈上升趋势，脯氨酸含量变化与蝴蝶兰[30]、垂穗披碱草[31]一致。而可溶性蛋白与可溶性糖的变化比较类似，并不是单纯上升趋势，而是在处理初期先出现降低，后又上升-降低-再上升的波动，上升并不明显，可能是这2 种物质对低温不敏感，导致在低温胁迫过程中合成的量很少。

植物正常的生命活动离不开光合作用，在低温胁迫环境下为了抵御低温，各项生命活动速率会有一定程度的降低，从而导致叶绿素含量降低[32]。随着温度的降低和胁迫时间的延长，秋石斛‘三亚阳光成苗叶片的叶绿素含量都呈下降趋势，这与低温条件处理下的柱花草[33]、蝴蝶兰[30]、茶树[27]叶绿素含量变化一致。

LT₅₀作为植物抗寒能力的重要生理指标之一，可以确定植物生态分布的最低温度[34]。该方法在红掌[35]、睡莲[36]等热带植物中都被用于快速鉴定植物的抗寒性。在本研究中，根据电导率求得的‘三亚阳光成苗的半致死温度为6.1℃，并且LT50 与游离脯氨酸、MDA 含量、落叶率均有极显著的正相关，与叶绿素含量呈极显著负相关，说明这些指标可以作为秋石斛‘三亚阳光成苗抗寒性评价指标。而在秋石斛‘三亚阳光中苗的研究中，可溶性糖也可以作为抗寒性评价指标，说明不仅在不同植物中抗寒关键指标存在差异，即使是同一种植物，不同年龄段期间指标选择也略有不同[37]。

通过对生理和形态指标分析发现，秋石斛‘三亚阳光成苗能抵御5℃低温持续2 d 时间，抵御10℃低温4 d 时间，5℃低温下超过2 d 或10℃低温下超过4 d 可能导致‘三亚阳光成苗植株收到损伤无法恢复，这与中苗和小苗的研究结果一致[37-38]。说明‘三亚阳光并没有因为苗期的增长导致抗寒性增加，只是评价指标略有差别。不像在乔木植物望天树中，随着树龄的增长，其抗寒性不断增强[39]。因此在实际生产中遭遇低温灾害时，不能因为秋石斛‘三亚阳光苗龄大就放松警惕降低保护，在面对不同苗龄的秋石斛低温胁迫时，要同样重视，保护措施需要到位。大多数植物经过低温锻炼能增强其抗寒能力，在了解了‘三亚阳光的耐寒温度与时间后，可以根据此数据进行低温锻炼，例如10℃低温锻炼2 d，5℃低温锻炼1 d 等。前人在自然低温条件下和模拟低温实验的研究中，‘三亚阳光与其他秋石斛品种比较，都属于是抗寒性较差品种[8， 40]。但是在16 个秋石斛品种的资源评价与筛选中，‘三亚阳光被认为是最具商业开发和产业化生产的品种，综合得分最高，表明其市场价值、经济效益都比较好[41]。因此本研究阐述了秋石斛‘三亚阳光在低温下的生理变化，探究‘三亚阳光不同苗龄低温胁迫下的生理反应，对其今后生产应用，抗寒育种提供理论依据，具有一定的意义。

但现如今秋石斛耐寒品种相对较少，为选育出更多有价值的耐寒性品种，后续研究可以对市场上较受欢迎的一些品种进行低温胁迫试验，测定生理指标，进行耐寒能力评价。如‘水晶‘金如意，经调查是较受欢迎的品种[41]，且在自然低溫下耐寒性较强[8]，可以进一步对这些品种进行低温胁迫试验，探究其生理响应机制，筛选更加优质的抗寒种质资源，为今后秋石斛产业发展奠定基础。宏观上可以通过对植物形态以及生理生化变化的研究来鉴定植物的抗寒性；微观上可以对植物的基因表达水平进行研究从而对植物的抗寒性进行评价。目前已经有许多与植物低温诱导表达相关的基因已经得到分离、鉴定，也获得了无需经过低温驯化抗寒能力就大有提高的转基因拟南芥植株[42]，但是秋石斛在耐寒基因方面的研究较少，今后也可以从分子方面入手，通过过表达耐寒基因培育出耐寒性较好的秋石斛品种。