菠萝PARMS反应体系的建立

高云飞　林文秋　吴青松　张秀梅　孙伟生　刘胜辉　姚艳丽

关键词：菠萝；SNP；PARMS；反应体系

中图分类号：S668.3 文献标识码：A

DNA 分子标记是根据基因组中DNA 片段差异来判断个体间遗传信息的差异。与传统表型性状选择相比，DNA 分子标记技术在基因或DNA水平上进行选择，可减少传统育种中的盲目性、选择效率低且易受环境条件影响等问题[1]。早期的分子标记技术主要包括AFLP （amplifiedfragment length polymorphism）、RFLP（restrictionfragment length polymorphism）、RAPD（randomamplified polymorphic）、SSR（simple SequenceRepeats）、SNP（single nucleotide polymorphisms）等。但由于AFLP、RAPD、SSR 等标记存在步骤繁琐、分型不稳定甚至是分型过多无法分辨以及非共显性等问题，使这些标记技术难以应用于育种工作中[2]。

随着高通量测序技术的快速发展，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms， SNP）标记被广泛应用于植物中。SNP 广泛分布于植物基因组中，是最丰富的DNA 变异形式[3-6]。基于SNP 开发的标记是第3 代的分子标记，被认为是极具应用前景的分子标记[7]。其主要技术有基因芯片技术（gene chips）[8]、直接测序法（directsequencing）[9]、CAPS（cleaved amplified polymorphicsequence）[10]、KASP（kompetitive al-lelespecific PCR）[11]和PARMS（penta-primer amplificationre-fractory mutation system）[12]等。其中，基于等位基因特异扩增的KASP 和PARMS 分型技术是目前主流的分型方法，具有成本低、耗时短、准确性高和通量高等优点。PARMS 分型的特点是在ARMS-PCR 的基础上，增加了2 条带有不同荧光的引物，经过与相同的反向引物的PCR扩增后，通过检测待测位点的荧光信号进行分型（图1）[13]。在作物遗传图谱构建、基因定位、种质资源分析、分子标记辅助育种等方面广泛应用[12， 14]，但在果树上应用较少，仅在桃、葡萄等果树上得到应用[15-16]。

目前，菠萝上主要利用SSR[17]、RAPD[18]、AFLP[19]、SRAP[20]和CAPS[21]等分子标记进行遗传图谱构建及种质资源遗传多样性的分析。但PARMS-SNP 分型技术在菠萝上的研究尚未见报道。本研究以3 份表型差异较大的菠萝种质为材料，分析反应体积、引物浓度和DNA 模板用量等因素对PARMS PCR 反应的影响，以期建立适用于菠萝的PARMS-SNP 分型体系， 为利用PARMS-SNP 分型技术开展菠萝种质资源鉴定、遗传图谱的构建、基因的精细定位和分子标记辅助育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用材料为农业农村部菠萝种质资源圃（湛江）保存的种质，选择表型差异较大的3份种质‘ Baro Rothchild ‘ James Queen 和‘Maroochy进行PARMS 反应体系的优化，65份种质用于体系验证。

1.2 方法

1.2.1 引物设计根据 130 份菠萝种质资源重测序数据及其SNP 位点信息，利用Primer Premier 5软件设计引物，命名为SNP31，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其上游引物序列（SNP31X、SNP31Y）分别为5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGACGCGTTCAAAATTTAAAGCCT-3' 和5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGACGCGTTCAAAATTTAAAGCCC-3'，下游通用引物序列（SNP31C）为5'-TCGTTTAATTTGAATCAGTCAACAACA-3'，其中下划线和双下划线分别为FAM 和HEX 荧光标签序列。

1.2.2 基因组DNA的提取 采用改良的CTAB法[22]和快速提取法[23]提取65 份种质的叶片总DNA，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的质量，NanoDropOne（Thermo Scientific 公司）检测DNA 的浓度。

1.2.3 PARMS 的基本反应体系反应体系为10 μL：1μL DNA 模板（100 ng/μL），5 μL PARMSmix（2×），0.45 μL 混合引物，3.55 μL ddH₂O。引物混合物在配制PCR 反应前预先混匀制备。

PARMS-PCR 扩增体系为94℃ 15 min；94℃20 s，65℃ 1 min（?0.7℃/循环），10 个循环；94℃20 s，57℃ 1 min，35 个循环；35℃ 1 min。利用Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 6 读取扩增产物的终点信号，使用其自带的软件进行SNP 分型分析。其中，连接FAM 荧光标签序列的等位基因型聚合在X 軸附近，连接HEX 荧光标签序列的等位基因型聚合在Y 轴附近，2 种等位基因的杂合型在中间显示。其分型结果通过基因型荧光信号点来判断，荧光信号值越高，PARMS-SNP 分型结果越好。

1.2.4 PARMS 反应体系的优化 设置4、6、8、10 μL 等4 种反应体积，其中PARMS master mix（2×）分别为2、3、4、5 μL，100 ng/μL DNA 模板为1 μL，100 μmol/L 引物混合物均为0.15 μL，ddH2O 分别为0.55、1.55、2.55、3.55 μL（表1），对反应体积进行优化。在此基础上进行引物浓度的优化，具体为：将SNP31 的3 条引物分别稀释成25、50、100 μmol/L 等3 种浓度后，进行PARMS反应。在PARMS 反应体积和引物浓度优化的基础上， 将‘ Baro Rothchild ‘ James Queen ‘Maroochy的DNA 分别稀释成100、50、25 ng/μL 的浓度，进行DNA 的浓度优化。

1.2.5 PARMS 反应体系的验证 利用65 份菠萝种质进行PARMS 反应体系的验证。

2 结果与分析

2.1 引物SNP31 的PARMS-SNP 分型结果

本研究在前期重测序的基础上，根据SNP 位点信息设计特异引物SNP31，该引物能够将8 份菠萝种质区分开来（图2）。其中，2 份种质的基因型为C：C，信号点为红色；4 份种质的基因型为T：T，信号点为蓝色；2 份种质的基因型为T：C 或C：T，信号点为绿色。表明SNP31 引物对8 份种质的分型效果较好，且阴性对照（NTC）位于原点附近，可用于后续的实验。

2.2 不同反应体积对PARMS-SNP 分型的影响

PARMS 反应体系中Master mix 是决定反应成本的主要组成部分，反应体积减少则Mastermix 用量减少（表1），可显著降低成本。因此，通过分析不同的反应体积对PARMS-SNP 分型的影响，结果表明，反应体积影响基因型信号点的荧光信号值。4、6、8、10 μL 等4 种反应体积，均实现了很好的基因分型。4 μL 的反应体积下，荧光信号值最低；6 μL 的反应体积下，荧光信号强度最强；8 μL 和10 μL 的反应体系处于二者之间（图3）。综合PARMS-SNP 分型结果及成本，选择6 μL 为最佳的反应体系。

2.3 引物浓度对PARMS-SNP 分型的影响

在已优化的PARMS 反应体系基础上，分析引物浓度对PARMS-SNP 分型的影响。结果表明，在引物浓度为25、50、100 μmol/L 时均能较好地进行分型，但其浓度显著影响荧光值，荧光值随着引物浓度的增加而增强，浓度为100 μmol/L 分型效果最佳（图4）。因此，选择100 μmol/L 作为6 μL反应体积下的最优引物浓度。

2.4 DNA 提取方法及浓度对PARMS-SNP 分型的影响

在已优化的反应体积和引物浓度的基础上，为了节省时间、节约成本，本研究比较CTAB 法和快速提取法提取菠萝叶片基因组DNA 对PARMS-SNP 分型的影响。结果表明，2 种提取方法均能对3 份种质进行较好的PARMS-SNP 分型（图5）。

分析DNA 浓度对PARMS-SNP 分型的影响，结果表明，DNA 浓度对PARMS-SNP 的分型影响较小。其中，以CTAB 法提取的DNA，100 ng 的荧光信号最强，25 ng 和50 ng 的荧光信号差异不显著（图5A）；而以快速提取法提取的DNA，稀释100 倍的荧光信号最弱，25 倍的荧光信号最强（图5B）。因此，CTAB 法提取的总DNA，选择100 ng 作为最优模板量，而快速提取法提取的总DNA，以稀释25 倍作为最优模板量。

2.5 PARMS-SNP 优化体系稳定性的验证

根据以上优化结果，确定了适用于菠萝的最佳PARMS 反应体系。总反应体积为6 μL，其中DNA（25 ng）1 μL，PARMS mix 3 μL，Primer mix（100 μmol/L）0.45 μL，ddH2O 1.55 μL。为验证该体系的稳定性，利用SNP31 对65 份菠萝种质进行分型。结果表明，利用该体系分型效果较好（图6），19 份种质资源的基因型为T：T，32 份种质资源的基因型为C：C，14 份种质资源的基因型为T：C 或C：T，说明本研究建立的PARMS-SNP优化体系稳定可靠。

3 讨论

随着生物技术的发展，作物育种由传统的田间选择育种转向分子标记辅助育种[24]。然而早期的分子标记技术如依赖于电泳分析，耗时费力且效率低下，影响了其在育种中的应用[25]。基于SNP位点开发的分子标记技术，具有数量多、通量高、可视化好等优点，逐渐成为基因分型的主流技术，广泛应用于种质资源鉴定、分子标记辅助育种中[26-27]。本研究首次建立了菠萝PARMS 体系并对其进行优化和验证， 获得稳定、可靠的PARMS-SNP 分型体系，为菠萝种质资源鉴定、QTL 定位和分子标记辅助育种提供技术支撑。

PARMS 技术受反应体积、引物浓度、DNA模板用量等的影响。反应体积显著影响基因型信号点的荧光值，大白菜的最适反应体积为4 μL[26]，番茄的最小反应体积为5 μL[27]，茄子的最小反应体积为6 μL[28]。本研究中，6 μL 的反应体积最佳，4 μL 和10 μL 的反应体系荧光强度减弱，表明反应体积影响PCR 扩增的效果，过高或过低的反应体积均对菠萝的PARMS-SNP 分型有影响。那么，反应体积如何影响PCR 扩增结果？杨双娟等[26]分析引物浓度、模板DNA 的用量等发现，反应体积是通过引物浓度的变化影响分型结果。而引物浓度是通过对引物与DNA 模板的匹配效率来影响KASP 分型结果[29]。引物浓度过低可能会提前消耗殆尽，导致PCR 反应提前终止；引物浓度过高容易发生非特异性扩增或形成引物二聚体，从而抑制目标序列的扩增[30]。本研究中100 μmol/L 的荧光信号值显著高于25 μmol/L 和50 μmol/L，表明引物浓度能够影响分型结果。DNA 模板是影响PARMS-SNP 分型的重要因素，适宜的DNA 模板量是获得足量特异性扩增产物的前提，DNA 模板浓度过低时，扩增产物较少甚至无扩增条带；浓度过高时，非特异性产物增加，特异性扩增受到抑制[26-27]。本研究中25～100 ng DNA模板量均能产生较好的PARMS-SNP 分型，表明菠萝PARMS- PCR反应对模板DNA 的浓度敏感度较小，这一结论与杨双娟等[26]和肖熙鸥等[28]的结果一致。

传统CTAB、DNA 提取试剂盒等方法提取DNA 耗时长、成本高，限制PARMS 标记的应用。因此，寻找一种适用于PARMS 标记的快速提取菠萝基因组DNA 的方法将有助于提高PARMSSNP的分型效率。LU 等[12]发现原始的DNA 裂解液不能对水稻、小麦、玉米和棉花等作物进行基因分型，但稀释5～30 倍的DNA 裂解液能将水稻、小麦、玉米成功基因分型，表明快速提取法获得的DNA 提取液可用于PARMS-SNP 分型，但基因分型的荧光强度受稀释倍数的影响，稀释20 倍以上导致荧光强度下降。本研究结果表明，以CTAB提取的DNA 和快速提取DNA 的稀释液为模板，均能够完成菠萝的基因分型，但快速提取法为模板的PCR反应，荧光强度值随着稀释倍数的增加，逐渐下降。可能原因是随着稀释倍数的增加，稀释液里的模板DNA 浓度下降，导致扩增效率降低，从而导致荧光值减弱。

4 结论

本研究通过对反应体积、引物浓度以及DNA模板用量等影响PARMS PCR 的因素进行優化，建立了菠萝PARMS-SNP 分型体系，其稳定性和可靠性得到了验证。该体系可用于菠萝种质资源的鉴定、QTL 定位和分子标记辅助选择等。